中华急诊医学杂志  2017, Vol. 26 Issue (8): 895-899
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顾建钦, 秦历杰. 缬沙坦抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞凋亡[J]. 中华急诊医学杂志, 2017, 26(8): 895-899.
Gu Jianqin, Qin Lijie. Valsartan inhibits angiotensin Ⅱ-induced vascular smooth muscle cell apoptosis[J]. Chin J Emerg Med, 2017, 26(8): 895-899.
缬沙坦抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞凋亡
顾建钦, 秦历杰     
450003 郑州，河南省人民医院急诊科
基金项目: 河南省科技攻关计划项目(122102310589)
通信作者: 秦历杰，Email：qinlijie1819@163.com.
摘要: 目的 研究缬沙坦对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞凋亡的影响，并探讨其机制是否与激活腺苷酸活蛋白激酶相关。方法 将大鼠胸主动脉平滑肌细胞(A7r5) 分为5组：① 对照(DMSO)组、② 血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)100 μmol/L组、③ 血管紧张素Ⅱ 100 μmol/L +缬沙坦(valsartan，Val)10 μmol/L组、④ 血管紧张素Ⅱ 100 μmol/L +缬沙坦10 μmol/L+复合物C(Compoud C，CompC)1 μmol/L组、⑤ 血管紧张素Ⅱ 100 μmol/L+5-氨基咪哇-4-甲酞胺核糖核普酸(AICAR) 100 μmol/L组，各组细胞予以相应药物处理24h后，用分光光度法检测细胞内Caspase 3活性；流式细胞术检测细胞凋亡率；蛋白印迹法检测细胞内AMPK总蛋白及磷酸化水平的变化；免疫荧光法检测细胞内活性氧(ROS)的含量；WST-1法检测细胞内总超氧化物歧化酶(SOD)活性；TBA法检测细胞内丙二醛(MDA)活性。多组定量资料比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t。结果 与对照组相比，Ang Ⅱ组细胞凋亡率增加[(45.46±15.40)%和(1.88±3.28)%，P=0.002]，细胞内ROS的生成增加[(9.24±0.46) 和(1.00±0.00)，P < 0.01]，Caspase 3活性增加[(35.03±3.54) 和(13.33±1.79)，P < 0.01]、MDA活性增加[(4.32±0.73) 和(2.05±0.18)，P < 0.01]，细胞内AMPK的磷酸化水平降低，SOD活性降低[(90.29±14.73) 和(136.02±18.82)，P=0.001]；与Ang Ⅱ组相比，Ang Ⅱ+Val组和Ang Ⅱ+AICAR组细胞凋亡率降低[(24.91±8.46)%和(45.46±15.40)%，P=0.031]；[(27.90±4.39)%和(45.46±15.40)%，P=0.038]，两组细胞内ROS的生成降低[(2.37±0.05) 和(9.24±0.46)，P < 0.01]；[(2.79±0.31) 和(9.24±0.46)，P < 0.01)]，Caspase 3活性降低[(18.08±2.69) 和(35.03±3.54)，P < 0.01]；[(27.83±3.56) 和(35.03±3.54)，P=0.002]，MDA活性降低[(3.25±0.55) 和(4.32±0.73)，P=0.017]；[(3.46±0.60) 和(4.32±0.73)，P=0.047]，AMPK的磷酸化水平增加，SOD活性增加[(140.71±20.27) 和(90.29±14.73)，P < 0.01]；[(116.73±17.96) 和(90.29±14.73)，P=0.029]；与Ang Ⅱ+Val组相比，Ang Ⅱ+Val+CompC组细胞凋亡率增加[(43.84±12.00)%和(24.91±8.46)%，P=0.043]，细胞内ROS的生成增加[(4.64±0.15) 和(2.37±0.05)，P < 0.01]，Caspase 3活性增加[(25.64±3.52) 和(18.08±2.69)，P=0.011]，MDA活性增加[(5.12±0.92) 和(3.25±0.55)，P < 0.01]，细胞内AMPK的磷酸化水平下降，SOD活性下降[(99.48±16.59) 和(90.29±14.73)，P=0.002]。结论 缬沙坦可以抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞凋亡，其机制可能与调节细胞内AMPK的磷酸化水平和ROS、SOD、MDA的活性相关
关键词: 缬沙坦     血管紧张素Ⅱ     血管平滑肌细胞     凋亡     腺苷酸活化蛋白激酶     活性氧     总超氧化物歧化酶     丙二醛    
Valsartan inhibits angiotensin Ⅱ-induced vascular smooth muscle cell apoptosis
Gu Jianqin, Qin Lijie     
Department of Emergency Medicine, Henan Provincial People's Hospital, Zhengzhou 450003, China
Corresponding author: Qin Lijie，Email：qinlijie1819@163.com
Abstract: Objective To investigate the impacts of valsartan on cell apoptosis induced by angiotensin Ⅱ in vascular smooth muscle cells, and discuss whether the mechanism is relevant to AMP-Activated Protein Kinases. Methods Vascular smooth muscle cells (A7r5) were designated to 5 groups:① control(DMSO) group, ② Angiotensin Ⅱ(Ang Ⅱ) 100 μmol/L group, ③ Angiotensin Ⅱ 100 μmol/L+valsartan 10 μmol/L group, ④ Angiotensin Ⅱ 100 μmol/L+valsartan 10 μmol/L+compoundC1 μmol/L group, ⑤ Angiotensin Ⅱ 100 μmol/L+5-Aminoimidazole-4earboxamide-ribo-nucle-oside(AICAR) 100 μmol/L group, after 24h incubation, the intracellular activity of Caspase 3 was measured by spectrophotometry, the cell apoptosis were enumerated by low cytometry, the intracellular AMP-Activated Protein Kinases (AMPK) phosphorylation and total expression quantity were examined by western blot, the intracellular reactive oxygen species (ROS) was measured by fluorescent probe DCFH-DA, the intracellular activity of total superoxide dismutase(SOD) was measured by WST-1 method, the intracellular activity of Malondialdehyde (MDA) was measured by TBA method. Two groups were compared by using Studentttest. Differences among multiple groups were evaluated by ANOVA. Results Compared with control group, the cell apoptosis of Angiotensin Ⅱ group was increased[(45.46±15.40)% vs.(1.88±3.28)%, P=0.002], the synthesis of ROS was increased [(9.24±0.46)vs.(1.00±0.00), P < 0.01], the activity of Caspase 3 was increased [(35.03±3.54)vs.(13.33±1.79), P < 0.01], the activity of MDA was increased [(4.32±0.73)vs.(2.05±0.18), P < 0.01)], the phosphorylation of AMPK was decreased, the activity of SOD was decreased [(90.29±14.73)vs.(136.02±18.82), P=0.001];compared with Angiotensin Ⅱ group, the cell apoptosis of Angiotensin Ⅱ+valsartan group and Angiotensin Ⅱ+AICAR group were decreased[(24.91±8.46)% vs.(45.46±15.40)%, P=0.031];[(27.90±4.39)% vs.(45.46±15.40)%, P=0.038], the synthesis of ROS was decreased[(2.37±0.05)vs.(9.24±0.46), P < 0.01];[(2.79±0.31)vs.(9.24±0.46), P < 0.01], the activity of Caspase 3 was decreased [(18.08±2.69)vs.(35.03±3.54), P < 0.01];[(27.83±3.56)vs.(35.03±3.54), P=0.002], the activity of MDA were decreased [(3.25±0.55)vs.(4.32±0.73), P=0.017];[(3.46±0.60)vs.(4.32±0.73), P=0.047], the phosphorylation of AMPK was increased, the activity of SOD was increased [(140.71±20.27)vs.(90.29±14.73), P < 0.01];[(116.73±17.96)vs.(90.29±14.73), P=0.029];compared with Angiotensin Ⅱ+valsarntan group, the cell apoptosis of Angiotensin Ⅱ+valsartan+compoundCgroup was increased[(43.84±12.00)% vs.(24.91±8.46)%, P=0.043], the synthesis of ROS was increased [(4.64±0.15)vs.(2.37±0.05), P < 0.01], the activity of Caspase 3 was increased[(25.64±3.52)vs. (18.08±2.69), P=0.011], the activity of MDA was increased[(5.12±0.92)vs.(3.25±0.55), P < 0.01], the phosphorylation of AMPK was decreased, the activity of SOD was decreased [(99.48±16.59)vs.(90.29±14.73), P=0.002)]. Conclusions Valsartan could inhibit angiotensin Ⅱ-induced vascular smooth muscle cell apoptosis via activating AMPK, suppressing the synthesis of ROS and the activity of MDA, elevating the activity of SOD.
Key words: Valsartan     Angiotensin Ⅱ     Vascular smooth muscle cell     Apoptosis     AMP-Activated Protein Kinases     Reactive oxygen species     Total superoxide dismutase     Malondialdehyde    

在动脉粥样硬化晚期，平滑肌细胞的异常凋亡将引起粥样硬化斑块破裂，导致急性冠脉综合征的发生[1]。血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)可以通过增加细胞内活性氧的合成诱导血管平滑肌细胞的凋亡[2-3]。而腺苷酸活化蛋白(AMPK)可以抑制血管平滑肌细胞内活性氧的生成[4]，AMPK活性增加可以降低气道平滑肌细胞的凋亡[5]。缬沙坦是临床常用血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂，具有多种心血管保护作用[6]，但有研究表明，缬沙坦的部分药理作用可能与激活细胞内的AMPK相关[7-8]。但是，目前仍不明确缬沙坦能否通过激活AMPK抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞凋亡。本课题研究了缬沙坦对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞凋亡的影响及其相关分子机制。

1 材料与方法 1.1 材料和主要试剂

大鼠胸主动脉平滑肌细胞株A7r5(上海中科院细胞库)；血管紧张素Ⅱ、缬沙坦原粉(大连美仑生物技术有限公司)；Compound C、AICAR(美国Sigma公司)；DMEM高糖培养基(以色列BI公司)；优质胎牛血清(兰州百灵生物技术有限公司)；Phospho-AMPKα(Thr172)、AMPKα抗体(美国CST公司)；Caspase 3活性检测试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、活性氧检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；总超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 细胞培养

大鼠胸主动脉平滑肌细胞株(A7r5) 培养在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，至于37℃、含5% CO2的培养箱中，3 d换液一次，细胞长至80%时，予以1: 2传代处理。实验所用细胞，均为状态良好的对数生长期细胞。

1.3 实验分组

将血管平滑肌细胞分为：① 对照(DMSO)组、② Ang Ⅱ组、③ Ang Ⅱ+ Val组、④ Ang Ⅱ+ Val+ CompC组、⑤ Ang Ⅱ+ AICAR组，各组细胞予以相应药物处理24 h，其中③ 组提前加入Val干预30 min；④ 组提前加入Val和CompC干预30 min；⑤ 组提前加入AICAR干预30 min。

1.4 Caspase 3活性检测

各组细胞相应药物处理24 h后，消化，离心收集细胞，加入裂解液，冰浴裂解15 min，离心，将上清液转移至预冷的离心管中。立即用酶标仪(美国Thermo SCIENTIFIC公司)检测各组细胞的吸光度值，并用Bradford法测定各组细胞的蛋白浓度，最后计算得出各组细胞的Caspase 3活性。

1.5 流式细胞术检测细胞的凋亡率

各组细胞相应药物处理24 h后，消化，离心收集细胞，用PBS洗涤后重悬，取10万重悬细胞，离心后加入195 μLAnnexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，再依次加入5 μLAnnexin V-FITC和10 μl碘化丙啶染色液，室温避光孵育15 min后上流式细胞仪(美国Thermo SCIENTIFIC公司)检测。

1.6 Western blot检测总蛋白及磷酸化水平

每样品取30 μg总蛋白上样，SDS-PAGE胶电泳，转膜(PVDF膜90V2 h)，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，相应一抗(1: 1 000稀释)孵育(4 ℃过夜)，TBST洗膜4次，每次5 min，二抗(1: 2 000稀释)室温孵育2 h，TBST洗膜，同前，将膜置于ImageQuant LAS4000机器(美国GE公司)中，加入超敏ECL化学发光液，进行曝光。

1.7 免疫荧光法检测细胞内活性氧的含量

各组细胞相应药物处理24 h后，去除6孔板中的培养基，每孔加入1 mL浓度为10 μmol/L的DCFH-DA。置于培养箱中30 min。用不含血清的培养基清洗细胞三次。然后用荧光显微镜(日本OLYMPUS公司)观察各组细胞内荧光强弱，拍照，用软件ImageJ 1.44p分析荧光值。

1.8 细胞内总超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)活性检测

各组细胞相应药物处理24 h后，消化，离心收集细胞，加入裂解液，冰浴裂解15 min，离心，将上清液转移至预冷的离心管中。按照试剂盒说明书步骤，用WST-1法检测SOD活性，用TBA法检测MDA活性。并用BCA法测定各组细胞的蛋白浓度，最后计算得出各组细胞内的SOD、MDA活性。

1.9 统计学方法

用SPSS 21.0统计软件进行数据分析。数据均采用均数±标准差(x ± s)表示，多组定量资料比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用最小有意义差异法(LSD-t法)，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 缬沙坦抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞凋亡

如图 1所示，与对照组相比，Ang Ⅱ处理血管平滑肌细胞24 h后显著增加细胞内的Caspase 3的活性(P < 0.01) 和细胞的凋亡率(P=0.002)。缬沙坦、AICAR(AMPK激活剂)均可显著抑制血管平滑肌细胞内Caspase 3活性(P < 0.01；P=0.002) 和细胞凋亡率的增加(P=0.031；P=0.038)。但是CompC(AMPK抑制剂)却可以减弱缬沙坦对细胞内Caspase 3的活性(P=0.011) 和细胞凋亡率的影响(P=0.043)。

与对照组相比, aP < 0, 01, 与Ang Ⅱ组相比, bP < 0, 05, bP < 0, 01, 与AngⅡ + Val组相比, cP < 0, 05 图 1 血管紧张素Ⅱ、缬沙坦对血管平滑肌细胞内Caspase 3活性和细胞凋亡率的影响 Figure 1 Effect of angiotensin Ⅱ and valsartan on activity of Caspase 3 in vascular smooth muscle cells and the cell apoptosis
图选项
2.2 缬沙坦增加血管平滑肌细胞内AMPK的磷酸化水平

如图 2A所示，缬沙坦处理血管平滑肌细胞24 h后可以剂量依赖性增加细胞内AMPK的磷酸化水平。如图 2B所示，Ang Ⅱ处理血管平滑肌细胞24 h后可以降低细胞内AMPK的磷酸化水平，缬沙坦、AICAR(AMPK激活剂)均可显著抑制平滑肌细胞内AMPK磷酸化水平的降低。CompC(AMPK抑制剂)显著抑制缬沙坦增加细胞内AMPK的磷酸化表达。

图 2 血管紧张素Ⅱ、缬沙坦对血管平滑肌细胞内AMPK的磷酸化和总蛋白水平的影响 Figure 2 A  Dose-effect relationship of valsartan on AMPK phosphorylation and expression in vascular smooth muscle cells.B Effect of angiotensin Ⅱ and valsartan on AMPK phosphorylation and expression in vascular smooth muscle cells.
图选项
2.3 缬沙坦抑制血管紧张素Ⅱ增加血管平滑肌细胞内活性氧的合成

用免疫荧光法检测细胞内的活性氧(ROS)含量。将各组细胞内荧光强度与对照组细胞内的荧光强度的比值，作为各组细胞内的相对活性氧含量。如图 3所示，与对照组相比，Ang Ⅱ处理血管平滑肌细胞24h后显著增加细胞内的活性氧含量(P < 0.01)。缬沙坦、AICAR(AMPK激活剂)均可显著抑制平滑肌细胞内活性氧的合成(P < 0.01；P < 0.01)。但是CompC(AMPK抑制剂)却可以减弱缬沙坦的抗活性氧合成能力(P < 0.01)。

与对照组相比, aP < 0, 01;与Ang Ⅱ组相比, bP < 0, 01;与AngⅡ + Val组相比, cP < 0, 01 图 3 血管紧张素Ⅱ、缬沙坦对血管平滑肌细胞内活性氧合成的影响 Figure 3 Effect of angiotensin Ⅱ and valsartan on synthesis of ROS in vascular smooth muscle cells
图选项
2.4 缬沙坦抑制血管紧张素Ⅱ对血管平滑肌细胞内总超氧化物歧化酶和丙二醛活性的影响

与对照组相比，Ang Ⅱ处理血管平滑肌细胞24h后显著降低细胞内的SOD活性(P=0.001)，增加细胞内的MDA的活性(P < 0.01)。缬沙坦、AICAR(AMPK激活剂)均可显著抑制平滑肌细胞内SOD活性的降低(P < 0.01；P=0.029) 和MDA活性的增加(P=0.017；P=0.047)。CompC(AMPK抑制剂)可以减弱缬沙坦对细胞内SOD(P=0.002) 和MDA活性的影响(P < 0.01)。见图 4。

与对照组相比，aP < 0.01，与Ang Ⅱ组相比，bP < 0.05，bP < 0.01；与AngⅡ+Val组相比，cP < 0.01。 图 4 血管紧张素Ⅱ、缬沙坦对血管平滑肌细胞内SOD、MDA活性的影响。 Figure 4 Effect of angiotensin Ⅱ and valsartan on activity of SOD and MDA in vascular smooth muscle cells
图选项
3 讨论

动脉粥样硬化是引起慢性缺血性心血管病的重要病理改变。血管平滑肌细胞的异常增殖、迁移和凋亡，在动脉粥样硬化的形成和发展中具有重要作用。研究表明，我国急性心梗患者发病率正逐年上升[9]，冠心病患者发生急性心梗后，血液内血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)的浓度明显升高[10-11]，而高浓度的Ang Ⅱ可以通过增加细胞内活性氧(ROS)的合成诱导血管平滑肌细胞的凋亡[2-3]，平滑肌细胞的异常凋亡又将引起粥样硬化斑块破裂，导致急性冠脉综合征的发生[1]，从而形成恶性循环，影响冠心病患者的预后。因此抑制血管平滑肌细胞的异常凋亡对改善急性冠脉综合征患者的预后具有重要意义。

本研究发现，血管紧张素Ⅱ可以降低细胞内总超氧化物歧化酶(SOD)的活性、增加丙二醛(MDA)的活性和活性氧的生成，并增加细胞内Caspase 3的活性，从而促进细胞的凋亡。

研究表明，活化的AMPK可以降低细胞内活性氧的合成，发挥细胞保护作用[4, 12]。本研究用AICAR(AMPK激活剂)预处理血管平滑肌细胞可以显著抑制血管紧张素Ⅱ对细胞内SOD、MDA、Caspase 3活性和活性氧合成的影响，这提示活化的AMPK可以通过降低活性氧的合成抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞凋亡。

缬沙坦是临床常用的血管紧张素Ⅱ 1型受体(AT1-R)拮抗剂之一，可以竞争性抑制Ang Ⅱ与AT1-R的结合，从而发挥降压、改善动脉粥样硬化形成的作用。尽管目前普遍认为缬沙坦的药理作用与拮抗AT1-R相关，但是仍有研究表明缬沙坦的部分药理作用并不依赖于拮抗AT1-R[13]。另外Ha等[14]研究表明，缬沙坦可以通过激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)抑制THP-1细胞内组织因子的表达，且该作用不依赖于拮抗AT1-R。基于上述认识，本研究发现，缬沙坦可以剂量依赖性增加血管平滑肌细胞内AMPK的磷酸化水平，并可以抑制Ang Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞凋亡，其机制可能与激活AMPK相关。但是Tea等[15]研究表明，使用缬沙坦处理自发性高血压模型大鼠2周，可以增加大鼠血液内Ang Ⅱ的水平，而增加的Ang Ⅱ可以通过与AT2-R结合，从而导致大鼠主动脉壁内平滑肌细胞的凋亡增加。因此，笔者推断冠心病患者发生急性心梗后，因血液内Ang Ⅱ的浓度明显升高[10-11]，短期内应用缬沙坦可以降低血管壁内平滑肌细胞的凋亡，但若长期使用缬沙坦可能会反馈性增加血液内Ang Ⅱ的水平，从而导致血管平滑肌细胞的凋亡增加，但该假设仍需进一步研究验证。

尽管本研究并未排除缬沙坦通过拮抗AT1-R发挥的药理作用，但仍可以从既得结果中得出结论，缬沙坦可以通过激活AMPK抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞凋亡，部分解释了缬沙坦在发挥降压作用的同时抑制动脉粥样硬化发生发展，改善急性冠脉综合征患者预后的可能机制。

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