2017, Vol. 26
急性一氧化碳中毒(acute carbon monoxide, CO)是全球致死率极高的“隐形杀手”之一[1]，CO中毒导致的脑损伤一般认为是脑缺氧引起，CO进入血液后，CO分子强力结合血红蛋白、细胞色素氧化酶、血红素蛋白，可直接导致组织缺氧，氧化应激以及神经元凋亡[2]，约有10%~30%患者在经历一定的“假愈期”后可出现CO中毒迟发性脑病(delayed neuropsychological sequelae，DNS)[3]。DNS的发病率较高，国内为10%~30%，国外为3%~40%[4]。
CysLT1R弱表达于脑组织，但在脑外伤、脑肿瘤、脑缺氧等病理过程后其表达可增加，期结果已证实急性CO中毒后CysLT1R的表达增高，证实了CysLT1R参与了DNS的发病过程，孟鲁司特为CysLT1R的特效拮抗剂，对大鼠缺血缺氧后损伤有保护作用，并且能减少神经细胞凋亡，减轻炎症损伤[5-7]，本研究通过应用孟鲁司特对CO中毒大鼠的行为学、病理组织学、神经细胞凋亡等方面的影响，来研究其对CO中毒DNS的作用、发挥作用的机制，为临床治疗提供新思路。
1 材料与方法 1.1 实验动物健康清洁级雄性SD大鼠90只，鼠龄6~8周，体质量(200±20) g，由徐州医学院实验动物中心提供。
1.2 实验试剂99.9% CO气体(济宁协力气体厂)，孟鲁司特(杭州默沙东制药有限公司)，TUNEL试剂盒(德国ROCHE公司)，多聚甲醛(北京化工厂)。
1.3 仪器设备Morris水迷宫及分析软件(Stoeling公司)，显微镜(德国Leica公司)，石蜡切片机(德国Leica公司)。
1.4 方法 1.4.1 急性CO中毒大鼠模型制备参照文献[8]大鼠经Morris水迷宫训练7 d，每日依次从4个不同象限面向池壁放入水中，记录大鼠巡游轨迹及逃避潜伏期。7 d后，巡游轨迹为直线式或趋向式，逃避潜伏期小于1 min为合格大鼠，大于1 min者淘汰。参考文献[9]制备急性CO中毒大鼠模型。将CO气体按照120 mL/kg快速注入大鼠腹腔，后每间隔4 h以首剂的2/3腹腔注射1次，共追加注射3次。对照组大鼠注射等量空气。
1.4.2 实验分组CO末次染毒结束后2 h迅速将存活大鼠随机(随机数字法)分为：CO中毒组(Mod组)，孟鲁司特低剂量组(ML组)(0.25 mg/kg)、孟鲁司特中剂量组(MM组)(0.5 mg/kg)、孟鲁司特高剂量组(MH组)(1.0 mg/kg)，每组10只。孟鲁司特溶于0.9%生理盐水经灌胃给药(3 mL/kg)，Con组和Mod组予等量0.9%生理盐水，分别于染毒后30 min、4 h、12 h各给药一次，后每12 h给药一次，连续给药7d。
1.4.3 碳氧血红蛋白(carboxy-hemoglobin, COHb)浓度测定采用改良的双波长COHb定量法测定，取大鼠尾静脉血0.1 mL加0.4 mol/L氢氧化铵20 mL混匀，10 min内于535 nm及578 nm波长下测定吸光度，COHb(%)=(2 144× A 535/ A 578-2 168)×100%。分别于染毒后第0.5 h、4.5 h、8.5 h以及12.5 h进行COHb测定，连续监测12 h内各组COHb浓度变化。
1.5 DNS大鼠的判定CO染毒后第21d行水迷宫试验，通过逃避潜伏期及穿台次数筛选DNS大鼠，若大鼠穿台次数低于3次，逃避潜伏期较染毒前明显延长，提示存在智力障碍，判定大鼠发生DNS [9]。
1.6 标本采集及处理染毒后第21 d，以10%水合氯醛按4mL/kg腹腔注射麻醉，经左心室升主动脉插管灌注，先快速灌注生理盐水，后用4%多聚甲醛灌注，肝脏变硬，四肢僵硬灌注结束，后断头取脑以4%多聚甲醛固定48h后行石蜡包埋，组织切片，行HE染色及TUNEL染色。
1.7 观察指标HE染色观察皮质、海马CA1区神经细胞病理变化，TUNEL法检测海马CA1区及大脑皮层细胞凋亡情况。TUNEL染色的阳性细胞(凋亡细胞)表现为细胞核呈棕黄色或棕褐色。
1.8 统计学方法用SPSS13.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差(x±s)表示，多组均数比较采用单因素方差分析，方差齐采用LSD-t法，方差不齐采用Dunnett’s T3法，DNS发生率比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 造模后大鼠行为表现染毒后约5~10 min大鼠出现呼吸急促，呼吸幅度增大，烦躁、多动、乱窜，肢端及尾部皮肤呈樱桃红色。染毒15 min左右逐渐出现四肢抽搐，部分大鼠发生角弓反张，另有部分大鼠出现四肢肌力下降，运动不能，瞳孔对光发射消失，甚至昏迷、死亡。对死亡大鼠解剖发现其脑组织充血水肿，心、肝脏及肠等胸腹腔脏器充血明显，特别是肝脏充血甚为明显，符合急性CO中毒表现。本实验水迷宫淘汰8只大鼠，剩余72只染毒，其中有32只大鼠死亡，病死率达44%。
2.2 大鼠静脉COHb浓度检测结果染毒前各组大鼠血碳氧血红蛋白浓度始终低于5%，染毒后0.5h后血碳氧血红蛋白浓度明显升高，达60%以上，连续监测12h，碳氧血红蛋白浓度始终>50%，符合中重度中毒标准，有利于迟发性脑病模型建立的成功，见表 1。
| 组别 | 染毒前 | 0.5 h | 4.5 h | 8.5 h | 12.5 h |
| Con组 | 1.2±0.4 | 1.2±0.3 | 1.2±0.4 | 1.2±0.4 | 1.2±0.3 |
| Mod组 | 1.2±0.5 | 60.8±5.4 | 57.6±3.5 | 55.3±3.1 | 53.7±3.7 |
| ML组 | 1.2±0.4 | 60.4±3.3 | 57.4±4.1 | 55.8±3.0 | 54.5±2.7 |
| MM组 | 1.2±0.6 | 60.1±2.6 | 58.8±4.2 | 55.9±2.7 | 54.2±3.3 |
| MH组 | 1.2±0.4 | 61.0±2.4 | 57.5±3.8 | 56.3±3.8 | 54.7±3.8 |
染毒前各组的逃避潜伏期差异无统计学意义(P﹥0.05)，染毒后，与Con组相比，Mod组、ML组、MH组大鼠逃避潜伏期显著延长(P < 0.05)，MM组大鼠Morris水迷宫逃避潜伏期有所延长，但差异无统计学意义(P﹥0.05)；与Mod组相比，孟鲁司特干预组大鼠逃避潜伏期均缩短，但仅MM组的差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 2。
| 组别 | 逃避潜伏期(s) | DNS例数(%) | 染毒21 d后 |
| 染毒前 | |||
| Con组 | 11.4±4.0 | 12.1±3.0 | 0(0) |
| Mod组 | 11.9±2.3 | 43.3±15.5 ab | 8(80) b |
| ML组 | 11.5±2.8 | 31.5±13.2 ab | 5(50) b |
| MM组 | 11.8±3.0 | 15.0±6.6 c | 1(10) c |
| MH组 | 11.0±3.8 | 30.1±12.2 ab | 4(40) b |
| 注：与染毒前成绩比较aP < 0.05；染毒后与Con组比较；bP < 0.05；与Mod组比较cP < 0.05 | |||
Con组大鼠未发生DNS，CO染毒各组均有大鼠发生DNS，CO染毒各组较COn组DNS发生率升高(P < 0.05)；MM组大鼠DNS发生率低于Mod组(P < 0.05)，见表 2。
2.5 HE染色结果 2.5.1 皮层病理学变化Con组神经细胞形态基本正常，核仁明显，胞核呈淡蓝色，Mod组可见神经细胞形态改变，呈三角形或圆形，空泡变性，细胞核碎裂，甚至消失，孟鲁司特各干预组大鼠神经细胞变性坏死较Mod组减轻，以MM组减轻最明显图 1。
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| A：Con组；B：Mod组；C：ML组；D：MM组；E：MH组 图 1 皮层HE染色形态学特征(×400) Figure 1 The pathologic change in cerebral cortex by HE(×400) |
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Con组海马CA1区可见锥体细胞排列紧密，约3~4层，细胞形态基本正常。Mod组可见锥体细胞排列紊乱，可见较多坏死神经元，呈三角形。孟鲁司特干预组锥体细胞排列较Mod组紧密，变性坏死神经元减少, 以MM组减少最明显图 2。
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| A：Con组；B：Mod组；C：ML组；D：MM组；E：MH组 图 2 海马CA1区HE染色形态学特征(×400) Figure 2 The pathologic change in hippocampus CA1 by HE(×400) |
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与Con组相比，Mod组、ML组、MM组和MH组大鼠皮层TUNEL阳性细胞明显增多，差异有统计学意义(P < 0.05)；与Mod组相比，孟鲁司特干预组大鼠皮质TUNEL阳性细胞减少，差异有统计学意义(P < 0.05)。与ML、MH组相比，MM组TUNEL阳性细胞数减少，差异有统计学意义(P < 0.05)。见图 3，表 3。
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| A：Con组；B：Mod组；C：ML组；D：MM组；E：MH组 图 3 大鼠皮层TUNEL染色(×400) Figure 3 Apoptosis of cerebral cortex by TUNEL(×400) |
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| 组别 | 皮质 | 海马CAI区 |
| Con组 | 6.2±2.4 | 3.6±2.0 |
| Mod组 | 42.8±6.6 a | 27.2±4.3 a |
| ML组 | 32.8±6.8 ab | 20.8±3.9 ab |
| MM组 | 25.6±5.2 abc | 15.7±3.5 abc |
| MH组 | 31.9±7.5 ab | 19.4±4.5 ab |
| 注：与Con组比较，aP < 0.05；与Mod组比较，bP < 0.05；与ML组比较，cP < 0.05 | ||
与Con组相比，Mod组、ML组、MM组和MH组大鼠海马CA1区TUNEL阳性细胞明显增多，差异有统计学意义(P < 0.05)；与Mod组相比，孟鲁司特干预组大鼠皮质TUNEL阳性细胞减少，差异有统计学意义(P < 0.05)，与ML、MH组相比，MM组TUNEL阳性细胞数减少，差异有统计学意义(P < 0.05)。见图 4，表 3。
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| A：Con组；B：Mod组；C：ML组；D：MM组；E：MH组 图 4 海马CA1区TUNEL染色(×400) Figure 4 Apoptosis of hippocampus CA1 by TUNEL(×400) |
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DNS主要是指急性CO中毒症状减轻后，经历2~60 d的“假愈期”后出现的以痴呆、锥体系和锥体外系症状以及精神症状为主的一系列神经精神异常，主要表现为记忆丧失，大小便失禁，共济失调，定向障碍，震颤麻痹，幻觉，以及其他运动障碍[10-11]。成功建立CO中毒模型是本实验的关键。本实验通过腹腔注射法制备CO中毒模型，连续间隔腹腔注射CO，较传统的吸入法具有操作简便，可行性好，安全性高等特点，连续监测12 h COHb浓度，结果可见12 h内COHb始终维持在50%以上，达重度中毒标准，符合临床过程，因此认定模型成功。
Morris水迷宫是一种研究空间学习记忆能力的标准模式，可评估大鼠学习与记忆能力，能客观的反映大鼠中毒后的认知功能改变。本实验发现，CO染毒后平均逃避潜伏期明显延长，DNS发生率增加，应用孟鲁司特后，大鼠平均逃避潜伏期均有缩短且DNS发生率降低，说明孟鲁司特可改善CO中毒大鼠认知功能，减少DNS的发生。病理学结果可见染毒各组皮层及海马CA1区病理损伤广泛，孟鲁司特干预各组皮层及海马CA1区病理损伤减轻，说明孟鲁司特可减轻神经细胞损伤。神经细胞凋亡在DNS发病过程中起重要作用，CO可作为信使分子激活可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)，催化三磷酸鸟苷(GTP)生成环鸟苷酸(cGMP)，cGMP是细胞信号转导重要的第二信使，可激活cGMP依赖性蛋白激酶(PKG)调节离子通道Ca2+通道的变化，促进神经细胞凋亡，此外，CO中毒后兴奋性氨基酸谷氨酸释放增加，促使促凋亡基因Bax表达增加导致细胞凋亡[12-13]。本实验结果发现染毒各组大鼠大脑皮层及海马CA1区神经细胞凋亡数较Con组明显增多，进一步说明了细胞凋亡参与了DNS的发病过程，可能是DNS的发病机制之一。
孟鲁司特是CysLT1R的特效拮抗剂，它能竞争性拮抗LTD4与CysLT1R的结合，作为非甾体类抗喘药临床疗效确切[14]，近年来孟鲁司特的脑保护方面的作用引起重视。全脑缺血损伤是继发于颅脑损伤、休克、缺氧等病理过程引起的炎症损伤性病变[15]，缺血缺氧是造成DNS的始动因素，DNS的发病机制之一类似于全脑缺血缺氧损伤过程，近期研究表明孟鲁司特可减轻全脑缺血后的炎症反应及神经元损伤[15]，减少神经细胞凋亡[5]。在大鼠局灶性脑缺血损伤模型中，CysLT1R在急性期(24 h内)主要表达在缺血损伤的中心区，而后期(7 d~14 d)则表达在增殖的星形胶质细胞，说明CysLT1R参与调节急性神经元损伤和后期胶质瘢痕形成[16]。而胶质疤痕的形成可阻碍神经纤维向缺血区的生长，影响脑缺血后的神经功能恢复[17-18]。
较多研究已证实CysLT1R拮抗剂的受体非依赖作用，其中一种可能是拮抗其他CysLT1R亚型，例如，孟鲁司特减轻局灶性脑缺血损伤的作用，可能与抑制尿嘧啶核苷酸/CysLT双重调节受体GPRl7的效应有关[19]，还可协同调节其他受体的效应，如肥大细胞的P2Y6受体[20]以及单核细胞的P2Y受体[21]。因此我们推测孟鲁司特可能是通过其本身的抗氧化应激，减少炎症浸润以及细胞凋亡而发挥对大鼠DNS的保护作用，而是否依赖其受体，还需进一步研究。
孟鲁司特对小鼠急性局灶性脑缺血呈浓度依赖性保护作用[22]，其有效剂量为0.1mg/kg，治疗时间窗为30min[22]。本实验为得到孟鲁司特发挥保护作用的最佳剂量，根据相关文献[15]将药物分为3个不同剂量，通过比较各组神经细胞凋亡来判断其发挥作用的最佳剂量。本实验结果发现用药各组大鼠神经细胞凋亡较Mod组减少，MM组大鼠神经细胞凋亡较Mod组减少最明显，MH组大鼠神经细胞凋亡介于ML组与MM组之间，说明孟鲁司特对DNS的保护作用具有剂量依赖性，且根据目前实验结果可见0.5 mg/kg对DNS的保护作用最强。
综上所述，本研究表明孟鲁司特可以减轻CO中毒后神经细胞损伤，改善认知功能下降，降低DNS发生率，其发挥作用的可能机制是通过其自身的抑制炎症反应、减轻炎症损伤，减少细胞凋亡，是否通过拮抗CysLT1R还需进一步研究。
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