心肌梗死(myocardial infarction, MI)是冠心病患者发生心力衰竭最重要的始动因素,其能导致有功能的心肌细胞丧失、心肌纤维瘢痕形成及心室重构。现有研究证实,心室重构包括心室形状改变的结构性重构及心肌细胞和细胞外基质改变的细胞性重构,心肌梗死随之而来的室腔扩大和神经体液系统激活,可刺激心肌纤维化,引起心功能的进行性恶化,最终导致死亡[1-4]。因此,寻找有效抑制心肌梗死后心室重构的治疗方法对改善心功能、延缓疾病进程具有重要意义。橙皮素(hesperetin)属于柑橘类药用植物果实的主要成分之一,广泛存在于花卉、水果等中,目前研究证实其具有抗氧化、减轻炎症、抗病毒、抗肿瘤等生物学作用。在心血管疾病中研究发现橙皮素能有效抑制主动脉缩窄术诱导的心肌肥厚、抑制血管紧张素Ⅱ或转化生长因子诱导的心脏成纤维细胞的胶原蛋白合成、降低脂多糖诱导的H9C2心肌细胞氧化应激水平,说明橙皮素是一种具有心肌保护作用的潜在药物[5-8]。然而,橙皮素在心肌梗死后心室重构及心功能恶化中的作用目前尚不明确。因此,本研究拟采用橙皮素干预心肌梗死小鼠模型,观察橙皮素对心肌梗死后心室重构及心功能的影响,从而为临床进一步延缓甚至逆转心室重构、改善心肌梗死后心力衰竭提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 实验材料雄性C57BL/6小鼠购于武汉大学动物实验中心(湖北,中国),橙皮素(溶解于0.5%羟甲基纤维素)购于上海融禾医药科技发展有限公司(上海,中国),TRIzol购于Sigma公司(圣路易斯,美国),实时荧光定量PCR试剂盒购于Roche公司(巴塞尔,瑞士),引物合成由上海生工生物工程股份有限公司提供(上海,中国)。
1.2 心肌梗死动物模型制备及动物分组采用左前降支结扎术制备心肌梗死模型,42只C57BL/6小鼠随机(随机数字法)分为假手术组(n=10) 及心肌梗死组(n=32),心肌梗死模型制备后24 h存活的小鼠再随机(随机数字法)分为心肌梗死对照组(n=15) 和橙皮素治疗组(n=17),橙皮素治疗组小鼠每日按1 mL/100 g体质量灌胃,心肌梗死对照组给予相同体积的0.5%羟甲基纤维素,共干预8周。经腹腔注射戊巴比妥钠麻醉成功后,将自制气管插管顺利送入口腔并连接呼吸机以辅助呼吸。胸部去毛消毒,正中开胸暴露心脏,钝性撕开心包,在左心耳下缘2~3 mm处结扎冠脉左前降支,可立即见结扎线以下心肌组织泛白发绀。然后依次缝合胸骨、肌层及皮肤。待小鼠恢复自主呼吸后送回鼠笼饲养。假手术组只穿线不结扎冠脉左前降支,其余步骤均同心肌梗死组制备。
1.3 超声心动图测定干预8周后,由超声科医师协助测量各组小鼠的左室后壁厚度(LVPWT)、室间隔厚底(IVST)、左室短轴缩短率(LVFS)及左室射血分数(LVEF),所有测量数值均测三次后计算平均值。
1.4 血流动力学测定超声心动图检测后,分离小鼠右侧颈总动脉,将预先肝素化的PE导管送入右侧颈总动脉并推送至左心室腔,再连接计算机软件分析及记录系统,同步记录左室内压峰值、左室舒张末期压,计算±dp/dtmax。
1.5 苏木精-伊红染色血流动力学测定后迅速打开胸腔,取出心脏,以10%KCl溶液灌洗心脏,4%多聚甲醛固定至少24 h。次日修剪心脏,依次完成酒精脱水、石蜡包埋、切片摊片、烘干、脱蜡、苏木精染色、盐酸酒精溶液分化、返蓝、伊红染色、脱水透明后封片保存。显微镜下观察心肌细胞整体排列情况,计算心肌细胞横截面积(cross-sectional area, CSA)。
1.6 天狼星红染色心脏标本固定、包埋、切片步骤同苏木精-伊红染色。然后烤片、二甲苯脱蜡、下行梯度酒精、0.2 g磷钼酸2 min、0.1%苦味酸天狼星红染色、0.01 mol/L盐酸2 min、上行梯度酒精和二甲苯透明、封片保存。显微镜下观察心肌纤维化情况,胶原纤维被染成红色,并计算胶原容积分数(collagen volume fraction, CVF)。
1.7 实时荧光定量PCR本研究采用实时荧光定量PCR技术测定心肌肥厚、心肌纤维化标志物的mRNA水平。以TRIzol法提取各组小鼠心肌组织的总RNA,运用紫外分光光度计测定RNA含量及纯度。吸取1 μg的总RNA逆转录为cDNA,以GAPDH为内参,采用10 μL反应体系进行PCR扩增。本研究中所用引物序列如下所示,ANP:5’ -ACCTGCTAGACCACCTGGAG-3’和5’ -CCTTGGCTGTTATCTTCGGTACCGG-3’;BNP:5’ -GAGGTCACTCCTATCCTCTGG-3’和5’ -GCCATTTCCTCCGACTTTTCTC-3’;β-MHC:5’ -CCGAGTCCCAGGTCAACAA-3’和5’ -CTTCACGGGCACCCTTGGA-3’;胶原蛋白Ⅰ:5’ -AGGCTTCAGTGGTTTGGATG-3’和5’ -CACCAACAGCACCATCGTTA-3’;胶原蛋白Ⅲ:5’ -CCCAACCCAGAGATCCCATT-3’和5’ -GAAGCACAGGAGCAGGTGTAGA-3’;CTGF:5’ -TGACCCCTGCGACCCACA-3’和5’ -TACACCGACCCACCGAAGACACAG-3’;GAPDH:5’ -ACTCCACTCACGGCAAATTC-3’和5’ -TCTCCATGGTGGTGAAGACA-3’。
1.8 比色法测定ROS含量本研究采用比色法检测各组小鼠心肌组织中活性氧物质ROS的含量。按心肌组织质量体积比,用生理盐水将各组心肌组织制备成10%的组织匀浆,3 000 r/min,4 ℃离心10 min。吸取组织匀浆上清再用生理盐水分别稀释成1%和0.5%的匀浆保存备用,比色法测定心肌组织中活性氧物质(超氧阴离子和羟自由基)的含量。
1.9 统计学方法所有连续变量数据以均数±标准差(x±s)表示,以SPSS 19.0统计学软件进行统计分析。多组间差异比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验,三组间小鼠生存率采用行列表确切概率法,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组小鼠生存状况观察每组小鼠8周后的生存状况,心肌梗死对照组小鼠因术后心律失常、肺部感染和慢性心力衰竭死亡4只;橙皮素治疗组的小鼠因术后肺部感染和慢性心力衰竭死亡2只(表 1)。此外,三组间小鼠的生存率差异无统计学意义(表 2)。
与假手术组比较,心肌梗死对照组的LVPWT和IVST增厚,LVFS、LVEF及±dp/dtmax显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。而橙皮素干预心肌梗死小鼠后LVPWT和IVST变薄,LVFS、LVEF和±dp/dtmax显著增加,差异有统计学意义(P<0.05),见表 3。
指标 | 假手术组(n=10) | 心肌梗死对照组(n=15) | 橙皮素治疗组(n=17) | F值 |
LVPWT (mm) | 1.77±0.04 | 12.85±0.10a | 12.29±0.05ab | 643.44 |
IVST (mm) | 0.95±0.02 | 11.89±0.06a | 11.44±0.09ab | 480.54 |
LVFS (%) | 34.45±3.91 | 20.69±3.99a | 29.48±3.87ab | 32.41 |
LVEF (%) | 63.56±1.31 | 30.51±1.17a | 46.40±1.68ab | 1 295.81 |
+dp/dtmax(mmHg/S) | 4 094.89±382.09 | 2 205.19±224.17a | 3 344.33±269.57ab | 109.48 |
-dp/dtmax(mmHg/S) | -2 526.44±255.32 | -1 566.91±217.37a | -2 250.40±218.35ab | 49.12 |
注:与假手术组比较,aP<0.05;与心肌梗死对照组比较,bP<0.05;LVPWT为左室后壁厚度,IVST为室间隔厚底,LVFS为左室短轴缩短率,LVEF为左室射血分数 |
显微镜下可见假手术组心肌细胞排列整齐、细胞间隙清晰;心肌梗死对照组心肌细胞排列紊乱、大量胶原纤维堆积;而橙皮素治疗组心肌细胞排列及细胞间隙较为整齐清晰(图 1A)。与假手术组比较,心肌梗死对照组、橙皮素治疗组的CSA显著增大(P<0.05);与心肌梗死对照组比较,橙皮素干预可显著减小CSA,差异有统计学意义(P<0.05) (图 1B)。
2.4 各组小鼠心肌组织PSR染色结果PSR染色显微镜下观察心肌纤维化程度,可见假手术组心肌细胞排列规则,红色胶原纤维极少;而心肌梗死对照组心肌细胞形态不规整、心肌间质胶原纤维增粗且排列紊乱,呈弥漫性分布;橙皮素治疗组心肌细胞排列较为规整,可见红色胶原纤维呈散在性分布(图 2A)。与假手术组比较,心肌梗死对照组、橙皮素治疗组CVF显著增大(P<0.05);与心肌梗死对照组比较,橙皮素干预可显著减小CVF,差异有统计学意义(P<0.05) (图 2B)。
2.5 各组小鼠心肌肥厚、心肌纤维化标志物的mRNA水平与假手术组比较,心肌梗死对照组和橙皮素治疗组心肌肥厚标志物ANP、BNP、β-MHC的mRNA含量显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);与心肌梗死对照组比较,橙皮素干预可显著降低以上心肌肥厚标志物的表达(P<0.05) (图 3A)。与假手术组比较,心肌梗死对照组和橙皮素治疗组心肌纤维化标志物胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ和CTGF的mRNA含量显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);与心肌梗死对照组比较,橙皮素干预可显著降低以上心肌纤维化标志物的表达(P<0.05) (图 3B)。
2.6 各组小鼠心肌组织中活性氧物质ROS的含量与假手术组比较,心肌梗死对照组和橙皮素治疗组心肌超氧阴离子、羟自由基的含量均显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。而与心肌梗死对照组比较,橙皮素治疗可显著降低超氧阴离子、羟自由基的含量,差异有统计学意义(P<0.05),见表 4。
指标 | 假手术组(n=10) | 心肌梗死对照组(n=15) | 橙皮素治疗组(n=17) | F值 |
超氧阴离子 | 103.33±7.65 | 211.82±9.22a | 164.33±8.76ab | 389.62 |
羟自由基 | 122.89±8.16 | 322.36±11.91a | 234.87±14.41ab | 648.96 |
注:与假手术组比较,aP<0.05;与心肌梗死对照组比较,bP<0.05 |
在本研究中,从超声心动图结果中可发现橙皮素干预能有效改善心肌梗死后心脏结构和功能参数、病理切片染色可发现其能有效减小心肌细胞CSA和CVF,分子生物学实验可发现橙皮素可降低心肌梗死后心肌组织中心肌肥厚、心肌纤维化标志物的表达,从而能改善心肌梗死后心功能。
心肌梗死发生后心肌细胞凋亡坏死,胚胎基因再表达的心肌细胞肥大,心肌细胞外基质过度纤维化或降解增加,导致心室扩张和球形改变等,这一过程被称为心室重构。心室重构早期为了维持正常的心输出量,血流动力学也会发生适应性变化;但在这种病理状态的持续影响下,会导致心脏负荷进一步加重、左心室舒张收缩功能明显减退,从而导致失代偿性心力衰竭的发生[9-10]。本研究中发现橙皮素干预后CSA明显减小,心肌组织中胚胎基因ANP、BNP、β-MHC的mRNA表达显著减少,且LVFS、LVEF和±dp/dtmax显著增加,说明橙皮素治疗能够抑制心肌梗死后心肌细胞胚胎基因的再表达,抑制心肌细胞肥大,延缓心室重构的进程,从而有效改善心肌梗死后心功能。既往研究已证实心肌梗死后心肌间质纤维胶原合成与降解的动态平衡被破坏,Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的CSF显著增高,引起心肌纤维化、左心室进行性扩张,最终导致心力衰竭的发生[11-12]。因此,有效抑制甚至逆转心肌纤维化对改善心肌梗死后心力衰竭具有重要意义。本研究中橙皮素治疗后可显著减小Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的胶原容积分数,心肌纤维化标志物胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ和CTGF的mRNA表达也显著降低,且LVFS、LVEF和±dp/dtmax显著增加,表明橙皮素治疗可以抑制心肌梗死后心肌间质的胶原含量,减轻心肌间质纤维化,逆转心室重构,有效改善心肌梗死后心功能。
研究表明,心肌梗死后心室重构时,氧化应激活性产物ROS (如超氧阴离子、羟自由基等)显著增加,其可破坏心肌细胞、心肌组织的正常结构及功能,从而进一步加重心肌损伤,促进心室重构的发展[13-16]。由此可见,氧化应激过程中ROS生成增加是心肌梗死后心室重构的机制之一,抑制ROS的生成也是逆转心肌梗死后心室重构、改善心功能的研究方向之一。本研究发现橙皮素治疗可显著抑制心肌梗死小鼠心肌组织中超氧阴离子、羟自由基的含量,这表明橙皮素具有抑制心肌梗死后ROS的产生,发挥抗氧化应激的作用,从而抑制心肌梗死后心室重构、改善心功能,这也与既往研究证实橙皮素具有抗氧化作用的结果一致[8]。
综上所述,橙皮素可能通过抑制活性氧物质ROS的产生,从而抑制心肌梗死后心室重构并改善血流动力学和心脏功能,这为橙皮素进入临床应用奠定了一定的实验基础和理论依据。然而,橙皮素抑制ROS产生的具体分子机制仍有待进一步的细胞与动物实验阐明。
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