三磷酸腺苷结合盒转运体G1(ATP-binding cassette transporter G1, ABCG1) 参与细胞内胆固醇(cholesterol)和磷脂(phospholipid)向高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)转运的过程，从而避免胆固醇严重沉积于外周细胞，在胆固醇逆向转运(reverse cholesterol transport, RCT)中起重要作用^[1-2]。ABCG1基因内或启动子区的SNPs与CAD的易感性有关^[3-4]。启动子区的SNPs能导致ABCG1的表达水平改变，从而导致个体对CAD易感性的差异，致使启动子活性下降的SNPs降低CAD的发病风险，其主要机制可能是诱导巨噬细胞的凋亡所致^[5-6]。然而ABCG1存在多个转录调控区(promoter region A, B, C等)，对于启动子区A中的SNPs是否与CAD的易感性有关也有研究报道^[3]，且与冠脉病变血管数相关^[7]。但rs1378577是否影响ABCG1启动子活性，以及在启动子A区是否存在其他与CAD易感性有关的SNPs尚不清楚，本研究拟通过Sanger法(双脱氧末端终止法)测序和双萤光素酶报告基因系统鉴定ABCG1启动子A区与CAD易感性相关的SNPs和单倍型，进一步揭示ABCG1参与CAD发生发展的分子遗传机制。

CAD组选择2008年10月到2009年11月期间，在广州医科大学附属第二医院、广东省人民医院心血管疾病研究所、中山大学孙逸仙纪念医院和南方医科大学珠江医院心血管内科住院行冠状动脉造影确定为CAD的患者217例，对照组纳入同一时期在广州医科大学附属第二医院体检部健康者142例。所有研究对象经询问均为确定三代以内为中国南方汉族人群。

(1) CAD入选标准：① CAD患者年龄 < 80岁；② 需经冠状动脉造影显示，在左冠状动脉主干、左前降支(含主要对角支)、回旋支(含主要边缘支)或右冠状动脉(含后降支或左室后侧支)中，至少有一支血管的狭窄程度≥ 50%，且至少2名副高及以上职称医师共同评判造影结果；③ CAD患者既往通过冠状动脉造影确诊为冠状动脉狭窄程度≥ 50%，或陈旧性心肌梗死。(2) CAD组排除标准：患者年龄≥ 80岁者、癌症患者和多器官功能衰竭患者都不予纳入CAD组。(3) CAD亚分组入选标准：病变数为二支血管及以上者纳入多支病变组(n=128)，一支血管病变纳入单支病变组(n=77)；冠心病患者中，男性年龄≤ 55岁、女性≤ 65岁纳入早发冠心病(premature coronary heart disease, pCAD)组，男性> 55岁、女性> 65岁者纳入非早发冠心病(non-premature coronary heart disease, non-pCAD)组，pCAD组(n=121)，non-pCAD组(n=96)。(4) 健康人群对照组入选标准：每年均参加健康体检，无胸闷、胸痛症状，无高血压病、高脂血症、糖尿病、CAD、心力衰竭、慢性肾功能不全、周围血管病、脑卒中等疾病，无既往心电图显示心肌缺血史，无肥胖(腰围：男 < 90 cm，女 < 80 cm)和无吸烟习惯(即吸烟年龄×每天吸烟支数 < 100)；或经冠状动脉造影示冠状动脉血管及其主要分支血管腔无狭窄。

E-Z 96TM Blood DNA Kit(OMEGA公司，美国)；Prime STAR Max DNA Polymerase(高保真聚合酶)、限制性内切酶：Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ、T4连接酶、大肠杆菌感受态细胞DH5α(Takara公司，日本)；去内毒素质粒小提试剂盒(TIANGEN公司，中国)；胎牛血清、高糖培养基(Gibco公司，美国)；内皮细胞基础培养基(Lonza公司，瑞士)；Luria-Bertani培养基(自配)；Lipofectamine 3000(Life公司，美国)；Dual luciferase reporter assay system(Promega公司，美国)；Veriti^TM梯度PCR仪(Applied Biosystems公司，美国)；细胞培养箱(Thermo公司，美国)；Berthold LB 9507超灵敏管式发光仪(Berthold Technologies公司，德国)。

采集CAD患者(n=217) 和对照者(n=142) 静脉血2 mL，EDTA抗凝，血液样本分装成0.5 mL/份存于-20 ℃以下冰箱备用。本研究已得到广州医科大学医学伦理委员会批准，并同所有受试者签订知情同意书。采用E-Z 96TM Blood DNA Kit提取血液基因组，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

所有受试对象均检测空腹血糖、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇等相关生化指标。

用NCBI数据库中的ABCG1基因序列(Accession No.: NW_004078109) 为参考序列，利用Primer premier 5.0进行引物设计。扩增ABCG1启动子区及构建组成型启动子单倍型的引物序列如下：Kpn Ⅰ-ABCG1，5’-CGGGGTACCAAGAATAAACAAAGC-3’；下游引物：Hind Ⅲ-ABCG1，5’-CCCAAGCTTAGTGAGCAGGGTTACTAAAG-3’；构建突变型启动子单倍型的引物包括Kpn Ⅰ-ABCG1、Hind Ⅲ-ABCG1、M-P2F、M-P3R、K-P2F和K-P3R，序列如下：M-P2F，5’-GTGAGAGCTGGGTAGATTTTCCTA-3’；M-P3R，5’-TAGGAAAATCTACCCAGCTCTCAC-3’；K-P2F，5’-GTGACTTGGGAGGGAACAGAACTG-3’；K-P3R，5’-CAGTTCTGTTCCCTCCCAAGTCAC-3’；等位基因特异测序引物为：ABCG1-SEQ2R，5’-GCAGTTCTGTTCCCTCA-3’。

反应体系：ddH₂O(双蒸水)22.4 μL，Prime STAR Max DNA Polymerase 25 μL，正向引物(10 μmol/L)0.5 μL，反向引物(10 μmol/L)0.5 μL，gDNA(10~30 ng/μL)1.6 μL，总体积50 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃10 s，60 ℃30 s，68 ℃1 min，共35个循环，最后68 ℃延伸3 min。

利用限制性内切酶：Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ分别对得到组成型和突变型ABCG1启动子单倍型PCR产物和pGL 3.0 control载体进行酶切，纯化后利用T4连接酶将ABCG1启动子片段定向连接到pGL 3.0 control载体，从而替换掉Luciferase基因上游的SV40启动子。载体与目的基因片段连接后，将它们的产物转入大肠杆菌感受态细胞(DH 5 α)，涂板，培养过夜，挑取单个菌落于5 mL Luria-Bertani培养基里，于37 ℃、225 r/min振摇培养过夜，用去内毒素质粒小提试剂盒提取质粒，后通过测序鉴定克隆片段序列的准确性。

人宫颈癌细胞(Hela细胞)和人冠状动脉内皮细胞(Human coronary artery endothelial cell, HCAEC)分别用高糖培养基(含10 %胎牛血清)和内皮细胞基础培养基(含2 %胎牛血清和生长因子)培养。于转染前一天铺板，Hela细胞和HCAEC分别按5 000/cm²和15 000/cm²铺板，于37 ℃, 含5% CO₂的二氧化碳培养箱培养过夜。利用Lipofactamine 3000将上一步中提取的ABCG1启动子载体质粒和pRL-SV40质粒共转染到Hela细胞及HCAEC中，以pGL3.0control载体作为对照，操作严格按照lipofectamine 3000说明书进行。

质粒转染细胞48 h后进行双萤光素酶报告基因活性分析，具体步骤按Dual luciferase reporter assay system厂家说明书进行，细胞裂解液的萤光素酶活性用Berthold LB 9507超灵敏管式发光仪进行测量，ABCG1各启动子单倍型的相对活性以其对应的萤光素酶活性比内参pRL-SV40的萤光素酶活性，然后除以对照pGL 3.0 control的荧光素酶活性的校正值。各单倍型的荧光素酶活性以3次独立实验的平均值为最终结果。

采用clustalx 1.81对测序的原始序列进行比对，应用TFSEARCH(http://www.Cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)对ABCG1启动子转录因子结合位点进行预测。采用SPSS 13.0统计软件，对数据进行统计。正态分布计量资料以均数±标准差(x±s)表示，非正态分布资料以中位数(四分位数)[M(P₂₅，P₇₅)]表示。计数资料采用频数及频率n(%)表示。一般临床资料不符合正态分布，采用两独立样本的Mann-Whitney U秩和检验进行比较。所有单倍型的荧光素酶活性均值结果均符合正态分布，采用成组t检验；对于不符合方差齐性的两组均值比较采用校正的t检验。多组间单倍型的荧光素酶活性均值结果比较：如符合正态分布、方差齐性，采用单因素方差分析；只符合正态分布不符合方差齐性，采用非参数Kruskal-Wallis秩和检验进行比较。采用GraphPad Prism 6对每种单倍型转录活性结果进行作图。两组间的等位基因、基因型及单倍型的频率分布比较：当n>40，采用χ²检验，当n < 40，采用fisher精确检验进行比较。采用Arlequin 3.5对所有研究对象的基因分型结果进行Hardy -Weinberg平衡分析。中性检验和SNPs位点间的连锁分析利用DNASP 4.50进行。

与对照组相比较，CAD组的年龄较高，且CAD组的女性比例较对照组低。相关生化指标空腹血糖、甘油三酯水平在CAD组增高，而CAD组总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平降低(P＜0.05)(表 1)。

通过对359个个体的ABCG1基因近端启动子区(约1 000个碱基对)进行测序分析，发现了3个SNPs位点，利用DNASP 4.50对所有序列进行Tajima’s D检验，Tajima’s D值为2.655，P＜0.01，提示该区域在进化过程中受到很强的自然选择压力，3个SNPs位点的等位基因频率较高且比较接近，是受到平衡选择的显著特征。本研究中鉴定出的3个SNPs位点分别位于ABCG1转录子A转录启始位点上游384，204和134位，即-384(A/G)、-204(A/C)和-134(T/G)。对3个SNPs位点的连锁分析显示它们处于强连锁不平衡，只组成3种单倍型，即ACG、GAT和GCG，其中，-204和-134位紧密连锁，即A-T和C-G连锁。

-384(A/G)、-204(A/C)和-134(T/G)等位基因频率和基因型频率分布在CAD组与对照组，pCAD组与non-pCAD组和单支血管病变亚组与多支血管病变亚组间差异无统计学意义。单倍型ACG、GAT和GCG在CAD组与对照组、pCAD组与non-pCAD组、单支血管病变组与多支血管病变组间中的频率分布也差异无统计学意义(表 2~4)。

为了排除年龄、性别、吸烟、高血压、高脂血症、甘油三脂、高密度脂蛋白胆固醇、血糖和尿酸等混杂因素对结果的影响，利用二元Logisitig回归分析，结果显示CAD与ABCG1启动子区多态性和单倍型没有显著相关性，ABCG1启动子SNPs和启动子单倍型没有最终进入方程。

在两种细胞中3个组成型单倍型的转录活性之间相比较差异仍无统计学意义(P>0.05)(见图 1B、1C)。在Hela细胞中GAG单倍型启动子活性与其他四个单倍型活性比较，差异皆有统计学意义(P＜0.01)，另一种突变单倍型GCT在hela细胞中的转录活性与GCG、GAT型单倍型活性比较差异无统计学意义(P>0.05)，所有组间比较采用非参数Kruskal-Wallis秩和检验，差异具有统计学意义(P=0.010 6)(见图 1B)；在HCAEC细胞中GAG单倍型启动子活性与ACG、GCG、GCT单倍型活性比较差异有统计学意义(P＜0.05)，GCT单倍型的转录活性与组成型单倍型活性比较无统计学意义(P>0.05)，所有组间比较采用单因素方差分析，差异具有统计学意义(F=4.72，P=0.006 3)(见图 1C)。

“pGL 3.0 con”表示“pGL 3.0 control”的荧光值。A：表示3个ABCG1启动子单倍型在Hela细胞中的转录活性；B：表示各ABCG1启动子单倍型及突变单倍型在Hela细胞中的转录活性；C：表示各ABCG1启动子单倍型及突变单倍型在HCAEC中的转录活性 图 1 各ABCG1启动子单倍型及突变单倍型在Hela细胞和/HCAEC中的转录活性 Figure 1 Transcriptional activity of ABCG1 promoter and mutant haplotype in Hela cell and /HCAEC

图选项

为了进一步排除年龄和性别的影响，对年龄和性别进行校正。年龄校正：排除对照组中年龄 < 50岁的个体，校正后CAD组[M(P₂₅，P₇₅)，n=217]与对照组[M(P₂₅，P₇₅)，n=114]间年龄分布差异无统计学意义(P=0.581)，性别校正是在年龄匹配的情况下，CAD组男性(n=159) 与对照组男性(n=58)、CAD组女性(n=58) 与对照组女性(n=56) 分别进行比较。结果显示，CAD男性亚组与对照组男性亚组间，以及CAD女性亚组与对照组女性亚组间的ABCG1启动子SNPs频率分布差异无统计学意义，三种启动子单倍型GCG、GAT和ACG的频率分布差异也无统计学意义(表 5)。

将含有ACG、GAT和GCG单倍型的启动子载体转染至hela细胞中，双萤光素酶报告基因系统分析显示，各组成型启动子单倍型的启动子活性相比较差异无统计学意义(P>0.05)，(见图 1A)。但当将GAT单倍型-134 T突变为G，得到新的单倍型GAG；或将GAT单倍型的-204位A突变为C，得到新单倍型GCT，将构建的2种突变启动子单倍型GAG和GCT及3种组成型载体ACG、GCG和GAT分别转染至Hela细胞和HCAEC中，利用双萤光素酶报告基因分析启动子活性。结果显示：

CAD是一种严重危害人类健康的疾病，动脉粥样硬化的形成是由多方面因素所致^[8]，其主要病理变化为动脉管壁沉积的粥样斑块，胆固醇和胆固醇酯则是构成粥样斑块的主要成分^[9-10]。ABCG1蛋白不仅在富脂的单核巨噬细胞中高表达，在人动脉内皮细胞中也高表达^[11]。单核巨噬细胞和动脉内皮细胞内的胆固醇变化会影响细胞的正常生理功能，如当巨噬细胞内胆固醇过高时，巨噬细胞会转变为泡沫细胞，参与动脉粥样硬化的发生；而内皮细胞的胆固醇增高会降低内皮细胞内的一氧化氮合酶活性和增加内皮细胞炎症反应，参与动脉粥样硬化的发生^[12]，所以影响ABCG1基因表达的因素将导致CAD易感性的差异。既往许多研究已证实ABCG1基因内或启动子区的SNPs与CAD的易感性有关，尽管ABCG1在CAD发生发展中的角色尚存在争议^[13]。SNPs是近年来研究发现的最有潜力的第三代分子标记，充分反映了不同个体间的遗传差异，具有数量多、分布广及遗传稳定性强等特点，目前已广泛应用于生物、生物进化、群体遗传学、疾病等领域研究中^[14]。Liu等^[15]发现ABCG1启动子SNPs(rs57137919 G>A)A等位基因携带者ABCG1表达水平明显下降，与CAD易感性降低有关。

本研究中-134(T/G)即为数据库中的SNPs(rs1378577)，王延风等^[3]曾报道rs1378577位点A/C基因多态性可能与中国人群心肌梗死有关联，C等位基因型携带者增加了心肌梗死风险。本研究中未观察到-134G(rs1378577C)与CAD的易感性、早发CAD及血管多支病等间的相关性，这与启动子活性检验结果相互印证。王延风等^[3]发现rs1378577 C等位基因增加MI的发生风险，但未检测附近其他SNPs位点，如果他们的研究中MI患者中较多个体rs1378577C与-204T、-384C组成单倍型CTC(即本研究中的GAG单倍型，本研究中为正义链)，ABCG1的表达水平将升高，发生CAD的风险升高，这与Liu等^[15]的研究结果一致。

ABCG1有7种不同的变异体，其中变异体5和变异体6都是由最上游启动子(启动子A)调控，转录后选择性剪接所得；变异体7和变异体4则有不同的启动子调控区，变异体4的启动子区位于变异体5的第2内含子中^[16-17]。本研究中的启动子区为变异体5、6的启动子(启动子A)，编码最长的转录本，而Liu等发现的影响启动子活性且与CAD易感性有关的SNPs(rs57137919G>A)则位于变异体4的启动子内。变异体4和其他变异体相比，不但前导肽不同，在功能区(268-277位)还有一段9个氨基酸的插入缺失，可见不同变异体在细胞间的定位和功能可能有差异，检测不同变异体的表达水平差异与CAD易感性的关系，也许可以进一步揭示ABCG1参与CAD发生发展的分子遗传机制。

有研究报道发现ABCG1启动子区-257T>G位点上，携带G等位基因可能会增加CAD多支病变的风险^[4]；Schou等^[6]报道ABCG1启动子区SNPs位点-376 C>T可能与心肌梗死、缺血性心脏病发病增加相关；笔者前期研究发现在隐性遗传模型下，rs1378577A/C与CAD多支血管病变相关^[7]。以上研究发现的CAD相关SNPs较少重复，不同的SNPs可能位于ABCG1的不同启动子区，调控不同的变异体。对于哪一个ABCG1变异体在细胞功能中发挥主导作用，哪一个启动子发挥主要调控作用，以及在不同人种间ABCG1的主要调控子是否不同也需要进一步研究。

本研究在ABCG1启动子A中发现3个SNPs位点，3个SNPs位点强连锁不平衡，只组成3种启动子单倍型，而且三种启动子单倍型的转录活性无统计学意义。但将组成型单倍型GAT突变为GAG后，转录活性升高1倍以上。在3个SNPs位点间，-204A和-134T，-204C和-134G紧密连锁，如果两位点间发生重组，与-384(A/G)中的G形成GAG和GCT单倍型，GAG导致启动子活性大大升高，然而，本研究在359例受试者中并未发现GAG单倍型，Liu等^[15]发现高表达ABCG1可诱导细胞凋亡，提示高转录活性的GAG单倍型可能不利于本研究群体个体的生长发育，在长期进化过程中逐渐被淘汰。核苷酸序列分析Tajima’s D值=2.655，提示该启动子区受到强自然选择压力，ABCG1的表达可能受到稳定性选择压力，因此，笔者推测ABCG1可能在个体发育中也扮演重要角色。

总之，ABCG1启动子A内的3个SNPs[-384(A/G)、-204(A/C)和-134(T/G)]的基因型、等位基因及单倍型的频率在CAD与对照组及各CAD亚组间分布无统计学意义，与CAD的易感性无显著相关性，3个单倍型对启动子转录活性无显著影响。