2017, Vol. 26
严重烧伤引起的应激性高血糖和胰岛素抵抗与患者病情及病死率密切相关[1-2]，而创 (烧) 伤时免疫功能起重要作用[3]。胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1) 是肠黏膜L细胞分泌的一种降血糖激素。Exendin-4(Ex-4) 作为一种GLP-1长效类似物，以葡萄糖依赖方式增加胰岛素的合成和分泌，适用于危重患者血糖的控制[4-5]。但是越来越多的研究发现，GLP-1类药物具有显著的免疫抑制作用，如能影响T淋巴细胞增殖[6]。笔者既往研究发现，Ex-4体内注射可以加重烧伤引起的T淋巴细胞免疫功能受损，促进向辅助性T细胞 (Th)2漂移，但是其神经内分泌调控机制不清。有资料提示，脑中风可通过激活交感神经而对外周产生免疫抑制效应[7]。另据报道，外周注射GLP-1可激活交感神经通路[8]。因此，笔者推测GLP-1可能通过激活交感神经通路调控外周T淋巴细胞免疫功能。本实验通过建立小鼠烫伤模型，采用β2肾上腺素能受体 (β2-AR) 阻断剂普萘洛尔 (propranolol，prop) 在体内和体外阻断交感神经，观察Ex-4对烫伤小鼠脾脏T淋巴细胞免疫功能的影响及其与交感神经调控途径的联系，为GLP-1类药物在危重症的应用提供预警。
1 材料与方法 1.1 实验动物、试剂和仪器健康雄性BALB/C小鼠 (北京华阜康科技股份有限公司)，清洁级，6~7周龄，体质量 (23±2) g。实验使用的主要试剂与仪器包括：Exendin-4(E7144，Sigma公司)、Propranolol (Sigma公司)、T淋巴细胞刺激剂刀豆素ConA (Solarbio公司)、白细胞介素 (IL)-2、IL-4、干扰素 (IFN)-γ(上海Excell Biology公司)、去甲肾上腺素和肾上腺素ELISA试剂盒 (南京建成生物工程研究所)、CCK-8试剂盒 (日本同仁化工公司)、GLP-1受体 (GLP-1R) 抗体 (Santa Cruz公司)、羊抗兔荧光二抗 (Jackson Immuno Research Laboratories公司)、含DAPI抗荧光衰减封片剂 (Vector Laboratories公司)、CD4+磁珠 (Miltenyi公司) 和TCS-SP5共聚焦显微镜 (Leica Camera公司)。
1.2 GLP-1受体免疫荧光检测磁珠分离正常小鼠CD4+ T细胞后 (约1×106/mL) 离心弃上清液，加入4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤残留固定液，用含1%牛血清白蛋白 (BSA) 的PBS溶液常温封闭细胞，加GLP-1R抗体 (1: 500)4 ℃过夜。第2天用含1%BSA的PBS洗涤细胞3次，1 200 r/min×5 min离心，加入荧光标记的二抗 (1: 300) 室温避光孵育1 h；PBS洗涤3次，1 200 r/min×5 min。取一滴细胞悬液滴至载玻片上，含DAPI抗荧光衰减封片剂封片，洁净盖玻片轻轻覆盖，静置5 min，封片剂凝固后，采用激光共聚焦显微镜观察。
1.3 动物烫伤模型的建立及分组小鼠背部备皮，第2天将动物按随机 (随机数字法) 原则分为假伤组和烫伤组，行乙醚麻醉，背部浸于15%总体表面积木质模具中，93 ℃热水烫伤7 s，达到Ⅲ度烫伤。碘伏消毒后颈部皮下迅速注射1 mL生理盐水补液。假伤组背部皮肤则浸于37 ℃水中7 s，其余条件同烫伤组。伤后27 ℃保温，常规喂养。
体外实验：小鼠烫伤24 h后处死，采用贴壁法分离脾脏T淋巴细胞，种植在96孔板 (5×105/孔)37 ℃孵育。A组：对照；B组：Ex-4(0.3 nmol)；C组：Ex-4+prop (1 nmol)；D组：prop；每组12孔。体内实验：假伤 (n=64) 或烫伤 (n=100) 动物随机 (随机数字法) 又分为4组，A组：对照；B组：Ex-4(0.001 μg/μL)；C组：Ex-4+prop (3 μg/μL)；D组：prop。烫伤前30 min腹腔注射prop (30 mg/kg) 或PBS 0.2 mL，伤后立即腹腔注射Ex-4(2.4 nmol/kg) 或PBS 0.2 mL。分别于6 h和24 h后处死，6 h组取血清，进行激素水平检测；24 h组取脾脏，进行T淋巴细胞功能检测。
1.4 脾脏单个核细胞的分离采用红细胞裂解法提取脾脏单个核细胞 (MNC)。取脾脏，细胞筛网 (直径72 μm) 研磨脾脏收集细胞悬液，离心 (1 200 r/min×10 min) 收集细胞沉淀，PBS混悬。吸取细胞悬液置于3倍体积的红细胞裂解液中，室温放置10 min，之后加等体积的PBS解除裂解液的作用，1 200 r/min×5 min离心后加适量PBS冲洗。收集细胞沉淀，加入1 mL含ConA (5 μg/mL) 和10%胎牛血清的全培养基，充分混匀后进行细胞计数。将所获取的小鼠MNC用含ConA的全培养基稀释 (2.5×106/mL)，以每孔200 μL细胞悬液种植在96孔板中 (5×105/孔)，37 ℃孵育48 h。
1.5 T淋巴细胞免疫功能和Th1/Th2分化的检测T淋巴细胞免疫功能包括细胞增殖和IL-2分泌，Th1/Th2分化以IL-4/IFN-γ比值表示[9]。细胞增殖是将96孔板中的MC在ConA刺激下37 ℃孵育48 h，收集上清液-20 ℃冻存 (150 μL/孔)。将各孔培养基补齐至100 μL，再加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h，采用ELX800酶标仪 (BioTec公司) 检测450 nm的吸光度值，作为细胞增殖参数。采用ELISA方法检测冻存上清液中IL-2、IL-4和IFN-γ含量。
1.6 血清激素水平分析各组小鼠烫伤后6 h，取眼球血置冰上，3 000 r/min×15 min离心，取上清液即血清，按照ELISA试剂盒说明书检测肾上腺素和去甲肾上腺素水平。
1.7 统计学方法应用SPSS 19.0统计软件，计量资料用均数±标准差 (x±s) 表示。采用单因素方差分析 (ANOVA) 对细胞增殖活性和细胞因子含量等数据进行组间比较，组间两两比较采用LSD-t法，以P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 GLP-1R在正常小鼠T淋巴细胞上的表达如图 1所示，GLP-1R定位于T淋巴细胞的胞膜及胞浆中，证实T淋巴细胞上存在GLP-1R，提示GLP-1可以对T淋巴细胞产生直接调节作用。
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A：GLP-1R (红色) 在细胞浆 (→) 和细胞膜 ( |
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24 h烫伤组与假伤组相比，T淋巴细胞增殖活性[10]和IL-2的分泌水平显著降低 (P < 0.05，图 2a、图 2b)。无论是假伤组还是烫伤组，体外Ex-4处理对T淋巴细胞增殖活性和IL-2分泌无明显影响。
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| 与假伤相同处理组比较，aP＜0.05；与对照组比较，bP＜0.05，与Ex-4+prop组比较，cP＜0.05 图 2 Ex-4在体外对烫伤24 h小鼠T淋巴细胞免疫功能和Th1/Th2分化的影响 Figure 2 The effects of Ex-4 on immune function and Th1/Th2 differentiation of mice T cells ex vivo |
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烫伤组各处理组IFN-γ分泌明显低于假伤组 (P < 0.05)；IL-4分泌则明显高于假伤组 (P < 0.05)，表明烫伤后T淋巴细胞向Th2漂移。假伤组内各处理组IFN-γ分泌没有明显差异，但是Ex-4与对照组相比IL-4分泌水平升高，表明Ex-4促使T淋巴细胞向Th2分化。而Ex-4+prop组IL-4的分泌与单独Ex-4处理组相比显著增加 (P < 0.05，图 2 d)，但与单独prop处理组差异无统计学意义。
在烫伤组内，Ex-4处理动物与对照组相比IFN-γ分泌降低 (F=80.539，P < 0.05，图 2c)、IL-4分泌升高 (F=15.416，P < 0.05，图 2d)；Ex-4+prop组与Ex-4组相比，IFN-γ和IL-4分泌无明显变化。
上述结果表明，Ex-4在体外对烫伤组与假伤组T淋巴细胞功能均无明显影响，但可促使T淋巴细胞向Th2分化，且不受prop影响，提示既往观察到Ex-4在体内对T淋巴细胞功能的抑制效应可能主要经由体内调节途径。
2.3 Exendin-4在体内对T淋巴细胞免疫功能的影响 2.3.1 T淋巴细胞增殖和IL-2分泌功能由表 1可见，烫伤组与假伤组相比，MNC数量增加，而T淋巴细胞增殖活性和IL-2的分泌水平显著降低 (F=20.932，P < 0.05)。在假伤组内，Ex-4处理组与对照组相比，MNC数量和T淋巴细胞增殖升高 (F=9.785，P < 0.05)，然而此效应并不能被prop阻断。与对照组相比，Ex-4使IL-2分泌水平降低；而Ex-4+prop组与Ex-4组相比IL-2分泌水平升高 (P < 0.05)，与对照组水平相似。
| 组别 | 单个核细胞计数 (106个/mL) |
增殖活性 (OD值) |
IL-2 (pg/mL) |
IFN-γ (pg/mL) |
IL-4 (pg/mL) |
IL-4/IFN-γ |
| 假伤组 | ||||||
| 对照 | 14.1L±3.7L | 0.737±0.034 | 537±43 | 490±104 | 9.95±1.22 | 0.02±0.01 |
| Ex-4 | 23.5L±6.6Lb | 0.914±0.108b | 367±86bc | 541±26 | 11.83±0.45 | 0.02±0.00 |
| Ex-4+prop | 25.0L±9.5Lb | 0.836±0.053 | 542±62 | 596±45 | 14.24±1.36 | 0.02±0.01 |
| prop | 14.2L±5.7L | 1.150±0.189bc | 710±68bc | 650±28 | 12.70±1.69 | 0.01±0.00 |
| 烫伤组 | ||||||
| 对照 | 28.2L±12.2La | 0.691±0.120a | 375±22a | 385±120a | 43.33±5.16a | 0.15±0.03a |
| Ex-4 | 14.5L±9.2Labc | 0.518±0.051abc | 220±43abc | 225±99abc | 55.93±9.38abc | 0.26±0.02abc |
| Ex-4+prop | 22.8L±11.5L | 0.675±0.069a | 374±79a | 376±124a | 106.21±19.06ab | 0.33±0.03ab |
| prop | 48.9L±11.6La | 0.860±0.165abc | 480±12abc | 436±83abc | 49.11±2.34abc | 0.13±0.03abc |
| 注：与假伤相同处理组比较, aP < 0.05；与对照组比较, bP < 0.05；与Ex-4+prop组比较, cP < 0.05 | ||||||
在烫伤组内，Ex-4处理组与对照组相比可明显抑制MNC数量、T淋巴细胞增殖和IL-2的分泌；Ex-4+prop组与Ex-4组相比，以上指标均显著升高 (F=11.507，P < 0.05)，提示prop可以阻断Ex-4对MNC数量和T淋巴细胞免疫功能的抑制效应。
2.3.2 Th1/Th2漂移变化烫伤组与假伤组相比，IFN-γ水平明显降低，IL-4水平则明显升高 (P < 0.05)，表明烫伤后T淋巴细胞向Th2漂移。在假伤组中，Ex-4不影响IFN-γ和IL-4的分泌，证实Ex-4对假伤组T淋巴细胞的分化不产生作用 (表 1)。
在烫伤组内，Ex-4处理可抑制IFN-γ的分泌 (F=5.34，P < 0.05)，并被prop逆转至对照组水平 (P>0.05)；相反；Ex-4处理组IL-4的分泌增加 (F=15.99，P < 0.05)，而Ex-4+prop组IL-4的分泌与Ex-4处理组相比也显著增加 (P < 0.05)，提示prop和Ex-4对IL-4分泌有协同效应。进一步分析发现，Ex-4处理组IL-4/IFN-γ明显升高 (F=14.145，P < 0.05)，Ex-4+prop组与Ex-4处理组相比IL-4/IFN-γ也明显升高，提示阻断交感神经后Ex-4对T淋巴细胞向Th2漂移的促进作用更加显著 (表 1)。
2.4 Exendin-4对儿茶酚胺分泌的影响烫伤组Ex-4各处理组儿茶酚胺分泌明显低于假伤组 (P < 0.05)，假伤组内各处理组去甲肾上腺素和肾上腺素分泌没有明显差异。在烫伤组内，Ex-4促进去甲肾上腺素的分泌增加，说明其可激活交感神经通路 (F=147.713，P < 0.05，图 3)，而抑制肾上腺素的分泌，提示对去甲肾上腺素转化成肾上腺素起抑制作用。Ex-4+prop组去甲肾上腺素和肾上腺素的分泌与Ex-4处理组相比急剧增加 (F=255.68，P < 0.05，图 3)，说明prop不仅不能阻断Ex-4的促去甲肾上腺素分泌效应，反而还可能存在协同作用，而对肾上腺素的抑制效应依赖于β2-AR。
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| 与假伤相同处理组比较，aP＜0.05；与对照组比较，bP＜0.05，与Ex-4+prop组比较，cP＜0.05 图 3 Ex-4在体内对烫伤小鼠血清去甲肾上腺素 (NE) 和肾上腺素 (E) 水平的影响 Figure 3 The effects of Ex-4 on serum norepinephrine (NE) and epinephrine (E) levels of burn mice |
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胰泌素类降糖药物在临床的广泛应用，所产生的与免疫相关的不良反应常引起争论，但是其确切机制尚不清[11]。作为一种脑肠肽，GLP-1无论在外周还是中枢都能激活下丘脑-垂体-肾上腺轴以及交感和副交感神经系统[8]。而严重烧伤本身可激活交感神经系统，并通过神经-内分泌-免疫网络调控外周免疫效应。交感神经调控炎症反应，具有早期促进炎症，晚期抑制炎症的特点[12]。我们的实验证实，GLP-1的免疫调节作用可能部分通过交感神经机制实现的。
研究表明，在蛋白和基因水平脾脏细胞上都存在GLP-1R的表达[13]。笔者进一步用免疫荧光方法发现GLP-1R定位于CD4+ T淋巴细胞的胞膜及胞浆中，提示GLP-1类药物可能对T淋巴细胞产生直接的调节效应。但是本研究证实，Ex-4在体外对烫伤组及假伤组小鼠T淋巴细胞的免疫功能没有明显影响，而体内注射Ex-4则抑制脾脏MNC数量和T淋巴细胞功能，提示Ex-4可能是通过体内某些途径或机制影响T淋巴细胞功能。进一步用prop阻断交感神经通路发现，被Ex-4抑制的T淋巴细胞功能恢复至正常水平，表明Ex-4在体内对T淋巴细胞功能的作用是通过激活交感神经通路实现的。有报道，交感神经激活后对外周组织产生免疫抑制作用，表现为脾脏MNC数量的减少和T淋巴细胞功能的下调[7]。与此研究相符，笔者发现prop单独作用后可恢复外周免疫功能。
相反，无论在体内还是体外，Ex-4都可促使T淋巴细胞向Th2分化，然而此效应可能与交感通路无关，在体内给予prop阻断交感反而能增强Ex-4的促Th2分化作用。烫伤及Ex-4刺激产生的儿茶酚胺均促进T淋巴细胞向Th2漂移，单独使用prop阻断β2-AR后，T淋巴细胞向Th1漂移；Ex-4增加IL-4分泌，抑制IFN-γ分泌，使T淋巴细胞向Th2漂移。二者共同作用时，虽然prop可以完全阻断Ex-4对IFN-γ的抑制效应，恢复至正常范围；但却意外使IL-4水平显著升高，免疫抑制更加严重。文献报道，激活β2-AR可使培养在低浓度IL-4中的初始T淋巴细胞分化成分泌大量IL-4的Th2细胞[14]。我们推测，由于正常小鼠Th2细胞上不表达β2-AR[15]，故单独使用prop对Th2分泌IL-4不产生影响，亦即prop组与对照组无明显差异。但是，由于Ex-4+prop组儿茶酚胺的水平急剧升高，可促使初始T淋巴细胞向Th2分化，分泌IL-4；另外，由于烫伤本身可使T淋巴细胞向Th2转移，prop能减少应激对细胞产生的凋亡作用，因此大量的Th2细胞为Ex-4促Th2分化效应奠定了基础。需要说明的是，本组实验初步观察到Ex-4促使Th2漂移的现象，但其确切调节机制有待进一步探讨。
本实验证实，给予烫伤小鼠外源性Ex-4可通过交感神经机制抑制脾脏T淋巴细胞的增殖和IL-2分泌，并经由GLP-1R直接作用于T淋巴细胞使其向Th2漂移。两种机制共同作用可导致机体免疫麻痹，这为GLP-1类药物在危重症的应用提供了免疫学预警。
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