自古以来,饮酒在人们生活、社交活动中都占有重要地位,但过量饮酒带来的健康和社会问题日益突出。在心血管系统疾病中,大量饮酒 (乙醇) 显著增加甘油三酯水平、损害血管内皮功能,促进动脉粥样硬化进展,增加冠心病和急性心肌梗死 (acute myocardial infarction,AMI) 的发病率和病死率[1-2],甚至在冠状动脉造影正常的人群中,大量饮酒也可能诱发AMI[3]。人体内乙醇被乙醇脱氢酶氧化为乙醛,后者主要在乙醛脱氢酶2(aldehyde dehydrogenases-2, ALDH2) 作用下进一步代谢为乙酸等排出体外。当ALDH2表达缺乏或功能障碍时会引起乙醛积聚导致组织细胞损害,而增强其表达能对抗心力衰竭发生和心功能降低[4]。可见,ALDH2在心血管疾病中发挥着重要的保护功能,其作用机制与包括PI3K/Akt通路在内的多条细胞生存调控通路有关[4],但具体机制尚不明确。本研究通过大剂量乙醇干预不同ALDH2基因型小鼠AMI模型,观察小鼠心肌梗死面积、心功能及PI3K/Akt信号通路关键分子变化,探讨亚急性酒精中毒对AMI后心脏结构和功能的影响,以及ALDH2在其中的作用机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物和试剂材料20只ALDH2基因野生型 (wild type,WT) 小鼠和32只敲除型 (knockout type,KO) 小鼠由日本大学医学部提供,均为12周龄C57BL/6雄性小鼠。主要试剂与材料:低渗裂解缓冲液、RIPA裂解缓冲液购自美国Sigma公司,兔抗PI3K (p110α) 单克隆抗体、兔抗p-Akt (Ser473) 单克隆抗体购自美国CST公司,小鼠抗β-actin单克隆抗体、山羊抗兔IgG/辣根酶标记二抗、山羊抗小鼠IgG/辣根酶标记二抗购自北京中杉金桥公司,ECL化学发光试剂盒、逆转录试剂盒购自美国Thermo公司,PVDF膜 (0.45 μm) 购自美国Millipore公司,BSA购自瑞士Roche公司,TRIzol购自美国Invitrogen公司,PCR引物由上海生物工程公司合成,其他常用试剂均为市售、分析纯。主要仪器:小动物高分辨率超声系统 (加拿大Visual Sonics公司),倒置显微镜 (德国Zeiss公司),紫外分光光度计 (美国Beckman公司),超微量紫外分光光度计 (美国Thermo公司),垂直和水平电泳槽、半干转印槽及凝胶成像系统 (美国Bio-rad公司),PCR仪 (日本Takara公司),小动物呼吸机 (中国青松生物医学仪器有限公司),AnaloxAM1乙醇分析仪 (英国Analox公司),FDC3500全自动干式生化分析仪 (日本富士公司)。
1.2 实验方法 1.2.1 动物饲养小鼠饲养于SPF环境中,控制室温22~25 ℃、湿度50%~60 %、光照明暗各12 h,投喂正常颗粒饲料,饮用灭菌纯净水。
1.2.2 实验分组及乙醇干预随机将WT和KO组小鼠分别分为两组,即野生型组 (WT)10只、野生型+乙醇组 (WT+E)10只、基因敲除组 (KO)16只、基因敲除+乙醇组 (KO+E)16只,所有的乙醇干预小鼠均予乙醇2 g/(kg·d)、连续8 d灌胃[5],对照组在相同时间经口灌胃等量生理盐水。
1.2.3 小鼠AMI模型建立乙醇干预结束次日所有小鼠经乙醚麻醉后固定,置于放大倍数40的倒置显微镜下。予气管插管,呼吸机维持呼吸。75%乙醇消毒皮肤,自颈正中切开,断第2、3肋骨,充分暴露主动脉和心脏。用眼科纤维手术镊子撕开心包膜,充分暴露心脏左室前壁,在肺动脉圆锥和左心耳交界处,略靠近左心耳下方分离左冠状动脉前降支,穿10号医用缝合线结扎,关闭胸腔。术后正常饮食,每日定时观察。
1.2.4 心功能检测建模后第7天以乙醚麻醉小鼠,取仰卧位固定,采用小动物高分辨率超声诊断仪经胸行超声检查。在二维切面上显示胸骨旁左心长轴,用M型超声心动图法分别测量左室短轴缩短率 (fraction shortening, FS)、左室射血分数 (left ventricular ejection fraction, LVEF) 和左室舒张末期内径 (left ventricular end-diastolic dimension,LVEDD)。超声检测仪所用参数对所有测试对象相同,每个数据测量5个不同的心动周期取其平均值。
1.2.5 血清乙醇浓度及肝功能指标检测小鼠心功能检测完毕后,经心脏取血,分离血清,使用AnaloxAM1乙醇分析仪并按照操作说明检测血清乙醇浓度。同时,利用FDC3500全自动干式生化分析仪检测肝功能,主要指标包括:总蛋白 (total protein,TP)、总胆红素 (total bilirubin,TBIL)、谷丙转氨酶 (alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶 (aspartate aminotransferase,AST)。
1.2.6 心肌梗死面积测定参照文献[6]方法以病理学大体观察测定心肌梗死面积。超声检查结束后快速摘取心脏,剪去心房、右心室及血管组织,放大倍数40的倒置显微镜下沿左心室非梗死区 (间隔部) 中线自心底至心尖将其剪开,平铺固定于琼脂板,数码相机微距拍摄左心室内膜面的照片,肉眼观察心肌组织苍白即判为梗死区,应用图像分析软件 (ImageJ1.46r) 分别测量梗死区及左心室总面积,心肌梗死面积=梗死区面积/左心室总面积×100%。
1.2.7 心肌组织ALDH2活性测定取左室心肌组织约100 mg,液氮下研磨成粉状,加入预冷的低渗裂解缓冲液100 μL提取心肌线粒体,随后使用超声破碎仪破坏线粒体膜释放线粒体内的酶待测。ALDH2活性是根据NAD+转化为NADH+的过程中应用紫外分光光度计测量波长340 nm的吸光度值而定,以乙醛为底物,反应缓冲液终浓度为20 mmol/L PBS缓冲液、1.25 mmol/L NAD和5 mmol/L乙醛,在加入乙醛后开始反应,ALDH2活性表示为mmol NADH/(min·mg)。
1.2.8 心肌组织PI3K、p-Akt蛋白表达水平测定使用组织匀浆器、以添加蛋白酶抑制剂PMSF和磷酸酶抑制剂NaF的RIPA蛋白裂解液提取左室心肌总蛋白,以超微量紫外分光光度计测定蛋白纯度及浓度,调至统一浓度加上样缓冲液后煮制备用。制作含有5 %浓缩胶和10 %分离胶的SDS-PAGE胶。水平拔出SDS-PAGE梳子后每个泳道加相应组别的蛋白100 μg和预染Marker,在垂直蛋白电泳槽内进行电泳,并在半干转印槽将蛋白转至PVDF膜,PI3K (110 000)、p-Akt (60 000)、β-actin (43 000) 半干转膜条件分别为23 V、90 min,23 V、55 min,21 V、41 min。转膜完毕后,迅速将PVDF膜转至5 %(m/v) BSA内,室温摇床上封闭2 h。随后加入一抗、4 ℃摇床上孵育过夜,一抗浓度均为1: 1 000。次日,于摇床上用TBST缓冲液洗涤一抗,加入二抗后室温摇床上孵育2 h,上述三种目的蛋白的二抗浓度分别为1: 20 000、1: 30 000、1: 40 000,所有一抗、二抗均使用5%(m/v) BSA配制。孵育结束后,TBST洗涤二抗,加上ECL发光试剂孵育1~3 min,于凝胶成像系统中采集图像,以β-actin作为目的蛋白内参,目的蛋白条带灰度值/相应β-actin条带灰度值即为目的蛋白的相对含量。
1.2.9 心肌组织caspase-3 mRNA表达水平检测利用NCBI数据库设计caspase-3和GAPDH基因引物序列,caspase-3 mRNA引物序列,正义5′-TGTCATCTCGCTCTGGTACG-3′,反义5′-CCCTTT CTGCCTGTCTTCTG-3′,扩增长度为419 bp;GAPDH引物序列,正义5′-CAAGGTCATCC ATGACAACTTTG-3′,反义5′-CAAGGTCATCC ATGACAACTTTG-3′,扩增长度为496 bp。TRIzol法提取心肌组织总RNA并调至统一浓度,采用RevertAidTMHMinus First Strand cDNA Synthesis kit试剂盒将RNA逆转录成cDNA,然后进行PCR扩增 (反应体系25 μL)。caspase-3 mRNA扩增条件:95 ℃ 5 min,94 ℃ 60 s,58 ℃ 60 s,72 ℃ 60 s,共30个循环;72 ℃延伸10 min。GAPDH扩增条件:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共36个循环;72 ℃延伸10 min。反应结束后,PCR产物用2 %琼脂糖凝胶进行电泳分析,采用Quantity one凝胶成像分析系统测定各相应条带的灰度值,选取GAPDH作为内参,以caspase-3/GAPDH比值作为目的基因的相对表达水平。
1.3 统计学方法采用SPSS 17.0统计软件进行处理,计量资料以均数±标准差 (x±s) 表示,组间比较采用One-way ANOVA分析,两两比较选择Bonferroni法。计数资料以率或构成比表示,组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 小鼠病死率的比较AMI建模后第7天WT组、WT+E组、KO组、KO+E组小鼠存活数量依次为8只、7只、11只、10只,病死率分别为20.0%、30.0%、31.3%、37.5%,各组间病死率比较差异无统计学意义 (P>0.05)。
2.2 小鼠血清乙醇浓度及肝功能变化按上述乙醇剂量干预后WT+E组、KO+E组小鼠血清乙醇浓度和TBIL、ALT、AST水平高于WT组和KO组,差异具有统计学意义 (均P<0.05);而WT+E组与KO+E组之间、WT组与KO组之间上述指标差异无统计学意义 (均P>0.05)。同时,TP水平在四组小鼠间差异无统计学意义 (均P>0.05)。见表 1。
组别 | 只数 | 血清乙醇浓度 (mg/dL) |
TP (g/L) |
TBIL (μmol/L) |
ALT (U/L) |
AST (U/L) |
WT组 | 8 | 26.72±4.22 | 46.65±6.73 | 15.36±4.30 | 52.25±8.44 | 43.68±7.50 |
WT+E组 | 7 | 34.99±4.38ab | 43.61±6.33 | 26.73±4.75ab | 69.93±9.20ab | 59.54±8.73ab |
KO组 | 11 | 27.19±5.06 | 45.18±6.52 | 16.62±4.42 | 54.30±10.13 | 46.13±9.49 |
KO+E组 | 10 | 38.70±6.35ab | 43.92±5.56 | 30.14±5.12ab | 78.60±12.7ab | 64.33±8.57ab |
注:与WT组比较,aP<0.05;与KO组比较,bP<0.05;TP为总蛋白;TBIL为总胆红素;ALT为谷丙转氨酶;AST为谷草转氨酶 |
心脏超声检查发现,与WT组、WT+E组相比,KO组、KO+E组FS、LVEF值均降低,差异有统计学意义 (均P<0.05);而LVEDD差异无统计学意义 (P>0.05)。WT组与WT+E组、KO组与KO+E组相比,上述指标均差异无统计学意义 (P>0.05)。见表 2。
组别 | 只数 | FS (%) | LVEF (%) | LVEDD (mm) |
WT组 | 8 | 57.37±10.21 | 68.58±11.68 | 3.76±0.73 |
WT+E组 | 7 | 54.63±13.18 | 65.16±13.34 | 3.97±0.70 |
KO组 | 11 | 39.15±11.86ab | 42.44±14.33ab | 3.80±0.67 |
KO+E组 | 10 | 36.78±15.33ab | 40.12±15.72ab | 4.00±0.89 |
注:与WT组比较,aP<0.05;与WT+E组比较,bP<0.05 |
心肌梗死面积测定发现,小鼠心肌梗死面积由大至小依次为:KO+E组>KO组>WT+E组>WT组,四组间差异均有统计学意义 (均P<0.05)。ALDH2活性测定发现,与WT组相比,WT+E组、KO组、KO+E组ALDH2活性显著降低 (均P<0.05);与KO组相比,KO+E组ALDH2活性显著降低 (P<0.05),而WT+E组ALDH2活性差异无统计学意义 (P>0.05)。见表 3。
组别 | 只数 | 心肌梗死面积 (%) | ALDH2活性 [mmol NADH/(min·mg)] |
WT组 | 8 | 20.32±10.03 | 5.92±1.14 |
WT+E组 | 7 | 34.16±11.46a | 3.53±1.07a |
KO组 | 11 | 51.60±13.52ab | 3.15±0.96a |
KO+E组 | 10 | 66.78±12.10abc | 1.07±0.89ac |
注:与WT组比较,aP<0.05;与WT+E组比较,bP<0.05;与KO组比较,cP<0.05 |
Western blot检测发现,四组小鼠心肌组织PI3K蛋白表达水平差异无统计学意义 (P>0.05);p-Akt蛋白表达由高至低依次为:WT组>WT+E组>KO组>KO+E组,四组间差异均有统计学意义 (均P<0.05)。RT-PCR检测发现,四组小鼠心肌组织caspase-3 mRNA表达由高至低依次为:KO+E组>KO组>WT+E组>WT组,四组间差异均有统计学意义 (均P<0.05)。见表 4、图 1。
组别 | 只数 | PI3K | p-Akt | caspase-3 mRNA |
WT组 | 8 | 0.98±0.21 | 0.88±0.10 | 0.23±0.07 |
WT+E组 | 7 | 0.89±0.18 | 0.63±0.14a | 0.46±0.11a |
KO组 | 11 | 0.77±0.23 | 0.50±0.21ab | 0.70±0.14ab |
KO+E组 | 10 | 0.78±0.12 | 0.22±0.09abc | 0.91±0.20abc |
注:与WT组比较,aP<0.05;与WT+E组比较,bP<0.05;与KO组比较,cP<0.05 |
冠心病严重危害人类健康、增加家庭和社会负担,是我国实施院前急救的最主要病因,其中,AMI是最危险的类型[7]。过量饮酒、吸烟、早发冠心病家族史、高血压、糖尿病等被公认为AMI的独立危险因素。大规模Meta分析证实,乙醇摄入量与冠心病发病率、病死率呈“U”或“J”形曲线关系,适当饮酒或不饮酒能够降低包括AMI在内的心血管疾病发生率及病死率,发挥心血管保护作用[8-9]。乙醇通过自由扩散进入细胞内进行代谢,主要被乙醇脱氢酶氧化为乙醛,进而在代谢关键酶ALDH2作用下形成乙酸,最终代谢为二氧化碳和水排出体外。适量乙醇能够作为ALDH2非特异性激活剂,增强ALDH2的表达及活性,改善糖尿病所致心肌损伤[10]。而大量饮酒过多地消耗ALDH2,降低其活性,使乙醛向乙酸分解的过程受到阻遏而引起乙醛浓度增高,刺激氧化应激、释放血管活性物质造成组织细胞损伤[11],引起血管内皮细胞功能障碍,加速动脉硬化的进展,长期酗酒甚至会引起栓子脱落、诱发AMI[12]。对心肌缺血诱发的损伤具有很强抵抗力的大鼠心脏中ALDH2活性一直处于较高水平,研究者推测很可能ALDH2能使心肌缺血大鼠体内醛类物质减少[13]。上述研究成果均提示ALDH2可能是AMI的重要保护因子,但其具体机制并不明确。心肌细胞存活数量决定了梗死面积,也就决定着AMI的预后,而PI3K/Akt信号通路在心肌细胞生存、坏死、凋亡等过程中发挥着决定性作用[14]。因此,本研究拟对不同ALDH2基因型小鼠施以大剂量干预模拟亚急性酒精中毒,再建立AMI模型,观察小鼠的心脏结构、功能及PI3K/Akt信号通路关键分子的变化情况,意在探索ALDH2在AMI过程中的作用及机制。
本研究发现,按照上述剂量的乙醇干预后小鼠血清乙醇浓度显著增高,出现转氨酶、胆红素升高的肝功能损害表现,提示大剂量的乙醇干预造成了小鼠亚急性酒精中毒。ALDH2基因敲除小鼠心肌内ALDH2活性显著降低,AMI建模后的心肌梗死面积显著扩大、心功能明显减退。亚急性酒精中毒明显降低ALDH2活性、增加心肌梗死面积,尤其是在ALDH2基因敲除小鼠中心肌梗死面积扩大最为明显;而对各组小鼠心功能影响并不显著。ALDH2基因敲除及亚急性酒精中毒对AMI小鼠心肌组织内PI3K蛋白表达无明显影响,而两者均能使心肌内p-Akt蛋白表达降低、caspase-3 mRNA表达增加,两者有引起叠加效应的趋势。
目前普遍认为,大量乙醇摄入使血液及心脏组织内乙醛蓄积,导致心肌肥厚、减弱心脏收缩功能、破坏心肌细胞内Ca2+稳态,而ALDH2能够显著降低乙醛的水平,从而拮抗乙醇的上述不良生物学效应[15]。外源性给予ALDH2激动剂Alda-1能够清除心肌缺血-再灌注损伤积聚的细胞毒性醛类物质,使心肌缺血损伤导致的心肌梗死面积减少达60%[13]。本研究同样也证实了ALDH2在AMI中的保护作用。调节细胞生存是ALDH2发挥心血管保护作用的重要机制之一,激活ALDH2能够显著减少心肌细胞坏死和凋亡[16]。PI3K/Akt信号通路是经典的调节细胞生存通路,Akt是其发挥效应的最关键分子。多种生长因子及刺激因素均能够激活PI3K/Akt信号通路,活化的PI3K将PI-4, 5-P2磷酸化为PI-3, 4, 5, -P3,后者作为第二信使,将信号传递到下游信号分子Akt,使Akt磷酸化而被激活。Akt活化后,能够向细胞质和细胞核转运,通过磷酸化作用激活或抑制下游靶蛋白,从而达到减少细胞凋亡、促进细胞生存的效能[17]。抑制心肌细胞的Akt活化能够降低抗凋亡分子Bcl-2表达,增加促凋亡分子Bax、Bad、caspase-3合成,促进凋亡[18]。细胞质内增加的Bax转位并结合到线粒体外膜,在线粒体外膜上形成通向细胞质的孔道,增强了线粒体外膜的透化作用,促使线粒体内细胞色素C、凋亡诱导因子和核酸内切酶G等促凋亡蛋白进入细胞质内并进一步激活caspase依赖和非依赖的细胞凋亡途径[19-20],其中caspase-3的激活是细胞凋亡过程中的一个重要环节。Bcl-xL能够结合到线粒体外膜的Bax再次转位回细胞质内,减弱线粒体外膜的透化作用,减少细胞的凋亡[19];当抑制Akt的活化时,心肌细胞内的Bcl-xL表达含量亦显著减少[21],可能会抑制Bax向细胞质的转位,进而增强线粒体外膜的透化作用,增加细胞凋亡。本研究发现ALDH2基因敲除和亚急性酒精中毒均使心肌内p-Akt表达降低、caspase-3 mRNA表达增加,且两者有叠加作用的趋势,由此推测维持ALDH2活性可能会激活PI3K/Akt信号通路、减少caspase依赖的心肌细胞凋亡,从而拮抗大剂量乙醇对AMI的损害作用。
一项以相同剂量乙醇干预ALDH2基因敲除小鼠的研究中观察到ALDH2基因敲除型小鼠的病死率高于野生型组[5],而本实验未能观察到各组病死率的差异,考虑有两方面原因:其一,大剂量乙醇干预后再建立AMI模型对小鼠的病死率产生影响;其二,实验样本含量小,观察的时间短。另外,因不能控制各组小鼠在经历大剂量乙醇干预及AMI造模两种处理后的存活数量一致,未采用析因设计分析明确上述两处理因素在各项检测指标中的交互作用,而采用完全随机化设计,仅能从各组各指标的数量变化观察两因素的交互作用趋势。
本研究提示,亚急性酒精中毒会加剧AMI后心脏结构损害,保护ALDH2功能可有效拮抗其对AMI后心脏结构的损害,其机制与PI3K/Akt信号通路介导的心肌细胞凋亡减少有关。临床实践中,对饮酒的患者进行ALDH2基因筛查,并试图保护和增强ALDH2活性,可能是AMI预防和改善预后的可行策略。
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