2017, Vol. 26
治疗性低温能改善心肺复苏患者神经功能的预后，使病死率下降，近几十年来被提倡使用。近些年动物实验研究发现，在复苏同时选择性降低颅温，可以明显提高动物的复苏成功率、生存率以及改善神经功能[1-2]。尽管实验研究从治疗效果上证实了心肺复苏同时启动头部快速降温能改善实验动物的存活率和神经系统功能，但其内源性保护机制还没有深入的研究。Zhao等[3]报道亚低温对脑缺血大鼠的神经功能的保护作用可能与PI3K/Akt (phosphatidylinositol 3 kinase-Akt) 信号通路的激活有关，而亚低温后如何通过PI3K/Akt/GSK3β通路参与心肺复苏后兔神经保护作用仍不清楚。本研究采用兔心内膜诱导室颤模型，比较复苏同时即刻降温与常规复苏和复苏后降温，不同方法对脑神经细胞凋亡影响；并观察各组脑神经细胞Akt、P-Akt、GSK3β、P-GSK3β(ser9) 的变化，初步探讨在体研究中亚低温如何通过PI3K/Akt/GSK3β通路调控凋亡，减轻脑神经损伤。
1 材料与方法 1.1 实验动物及分组30只成年健康雄性新西兰家兔，体质量约2 kg，由第二军医大学实验动物中心提供[许可证号：SCXK (沪)2013-0007]。采用4 min室颤模型，随机 (随机数字法) 分为5组：假手术组 (Sham组)；常温复苏组 (NT组)；复苏即刻降温组 (IATH组)；复苏即刻降温+LY294002(LY294002组)；复苏后1 h降温组 (PATH组)，每组6只。
1.2 CPR模型的制备术前12 h禁食不禁水，戊巴比妥钠30 mg/kg, 经耳缘静脉注射麻醉。兔子平卧位固定于操作台上，心电监护。在兔颅顶部，两眶连线与矢状线的交点向左偏约3~5 mm的位置剪开头皮，钉子在颅骨钻孔，将温度计探头置与脑内，长度1 cm左右，缝线固定，骨蜡将孔填封。三号气管导管经口置入气管。分离出左股动脉，PE-50聚乙烯导管置入约15 cm，到达兔胸主动脉，测量主动脉压、动脉血气。分离出左股静脉，PE-50聚乙烯导管置入约20 cm到达下腔静脉，用于抽血送检及复苏时给药。分离出左颈动脉，PE-50聚乙烯导管置入约12 cm，到达左心室内，通过接驳换能器，检测血流动力学指标。最后分离右颈静脉，先放置自制鞘管，到达上腔静脉右心房入口处，经该鞘管内再置入儿童深静脉导管的导丝 (正极) 到达右心室内膜，同时负极针头于心尖部皮下插入，两者共同组成交流电回路用于诱导室颤。内置式温度探头置入肛门，记录核心温度。术前将兔核心温度控制持在 (38.5±0.1)℃。
通过右心内膜导引钢丝，以4 mA交流电与动物心前区体表负极针头形成交流电回路持续致颤2 min。以致颤开始心电监护示动脉血压迅速低至25 mmHg (1 mmHg=0.133 kPa) 以下，并且动脉搏动波形消失几乎成一直线，停止致颤后心电图波形呈室颤或无脉性电活动来判断CA成功。致颤成功后，将导丝拔除并将颈外静脉结扎。
4 min无处理室颤后，参照Utstein模式经行心肺复苏。人工胸外按压根据节拍器以频率200次/min进行按压，部位为兔胸骨柄正中，深度控制在胸廓前后径的1/3，按压放松比为1: 1。并行机械通气 (40次/min、潮气量为20 mL、FiO2 100%)。通气按压2 min后给予肾上腺素 (20 μg/kg) 经股静脉静推。并继续按压2 min后，给予单次能量25 J (双向波) 除颤，除颤后继续呼吸机通气及胸外按压，若恢复自主循环则停止通气按压；若没恢复继续就通气按压60 s后再予能量25 J (双向波) 除颤一次，未能恢复自主循环则继续重复以上操作。若自主循环没恢复，可在复苏6 min再给予一次相同剂量肾上腺素。以恢复室上性心律，平均动脉压>60 mmHg并且维持10 min以上，判断为自主循环恢复 (ROSC)。经上述复苏10 min未恢复自主血压心率认为复苏失败。ROSC的动物复苏后连续监测4 h血流动力学。试验结束后拔除所有导管，回笼观察其复苏后存活时间，观察终点为24 h。在实验完成后所有的动物常规解剖了解手术或复苏过程有否机械性损伤。所有实验参数设计和记录均参照实验研究的Utstein模式[4]。
1.3 主要仪器试剂上海奥尔科特公司ALC-V8小型动物呼吸机；西门子Siredoc 220;监护仪；深圳华宜仪表有限公司MS6501数字温度计；PE50聚乙烯导管 (美国Becton-Dickinson公司)；肝素 (上海第一生化制药有限公司，规格12 500 U/2 mL，批号1506103)；盐酸肾上腺素注射液 (上海禾丰制药有限公司，规格10 mg/1mL，批号10150505)；羊抗兔P-Akt多克隆抗体 (美国SantaCruz公司)；羊抗兔P-GSK3β多克隆抗体 (美国SantaCruz公司)。
根据半导体降温原理及组织间热传导原理，自行研制设计出了适用于家兔颈部降温装置。该装置主要包括半导体制冷片、铜块、铜片、散热器及其他电器原件构成 (图 1)。半导体制冷片两边分别接有铜块，一边用来降温，一边用来散热，降温侧连接环绕成适合家兔颈部大小的铜片，散热侧连接散热器。电路控制系统采用12 V直流电源，温度控制器采用单片机控制电路，可以调节温度上下限，在电脑温度设定范围内工作。前期研究笔者发现本装置降温速率快，降温效果可靠。
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| 图 1 颈部降温装置 Figure 1 Neck cooling equipment |
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将颈部降温装置放置于动物颈部，要求30 min家兔脑温降至34 ℃，以后维持目标脑温至ROSC后4 h，同时实验过程中动态监测肛温。
1.5 检测项目和方法 1.5.1 蛋白印迹 (Western Blot)检测脑组织Akt、P-Akt、GSK-3β、P-GSK-3β(ser9) 的表达。复苏成功后24 h，处死动物，迅速剥离颅骨取出脑组织至于冰器皿上，分离出大脑皮层，置于液氮罐冻存。将冻存脑组织，加入到RIPA缓冲液中，用匀浆器打碎，置冰上放置5 min，再离心5 min (13 000 r/min)。取上清液测定蛋白浓度 (lowry法)。进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)，电转移至硝酸纤维素膜。加一抗孵育摇晃过夜，加二抗，抗鼠HRP辣根过氧化物酶室温摇晃1 h，加发光剂，X线胶片曝光，压片约2 min，显影。X线片进行密度扫描。所得结果以GADPH为参照，应用ImageJ1.40软件进行灰度扫描分析。
1.5.2 脑组织凋亡细胞检测24 h后，兔过量麻醉处死，生理盐水PBS分别心脏灌注，取出完整大脑，切取3.0 mm脑片，4%多聚甲醛固定24 h。凋亡细胞采用TUNEL法检测，按试剂说明书进行操作。光镜下观察切片，凋亡细胞均为细胞核中有棕黄色颗粒。每张切片选择10个不重叠的高倍视野 (HP) 计数，取平均值。
1.6 统计学方法采用SPSS 20.0统计软件对实验数据进行方差分析，计量资料采用均数±标准差 (x±s) 表示。组间比较采用one-way ANOVA方差分析，多个样本均数两两比较用SNK-q检验。以P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 一般参数采用单因素方差分析比较常温复苏组 (NT组) 复苏即刻降温组 (IATH组)，复苏中降温+LY294002(LY294002组), 复苏后1 h降温组 (PATH组) 的体质量和手术时间，结果显示差异均无统计学意义 (P＞0.05)。
2.2 各组间P-Akt、Akt的变化与Sham组比较，常温心肺复苏组兔脑细胞胞质中的Akt (Thr-308) 磷酸化水平 (p-Akt) 在心肺复苏后24 h明显减低 (P < 0.05)；复苏即刻颈部降温组p-Akt水平在心肺复苏后24 h较常温复苏组明显增强 (P < 0.05)；复苏后1 h降温组p-Akt蛋白表达水平24 h也较常温复苏组有增强 (P < 0.05)，但弱于复苏后即刻颈部降温组；脑室内注射LY294002去除了亚低温的这一作用，表明了LY294002抑制Akt的磷酸化，从而抑制p-Akt在亚低温减轻心肺复苏后脑损伤所起的作用。提示亚低温是通过激活PI3K/Akt途径而增加p-Akt的表达，降温时间越早这一作用越明显。各组对总Akt蛋白表达均无明显影响。见图 2、3。
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| 图 2 24 h各组Akt、p-Akt蛋白表达 Figure 2 Expression of Akt and p-Akt in each group at 24 h |
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| 与常温复苏组 (NT) 组比较，aP < 0.05；与复苏即刻降温组 (IATH) 组比较，bP < 0.05 图 3 低温对P-Akt的影响及LY294002的干预作用 Figure 3 Effect of hypothermia on P-Akt and intervention of LY294002 |
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与Sham组比较，常温心肺复苏组兔脑细胞胞质中的GSK-3β磷酸化水平 (P-GSK3β) 在心肺复苏后24 h明显减低 (P < 0.05)，与常温心肺复苏组比较，复苏即刻颈部降温组和复苏后1 h降温组P-GSK3β(ser9) 的表达水平升高，脑室内注射LY294002去除了颈部降温的这一作用，表明了LY294002抑制Akt的磷酸化，进而抑制GSK3β磷酸化。提示脑缺血预处理是通过激活PI3K/Akt途径而增加P-GSK3β(ser9) 的表达的。各组对GSK3β蛋白表达均无明显影响 (P>0.05)。见图 4、5。
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| 图 4 24 h各组GSK3β、P-GSK3β蛋白表达 Figure 4 Expression of GSK3β and P-GSK3β in each group at 24 hours |
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| 与常温复苏组 (NT) 组比较，aP < 0.05；与复苏中降温组 (IATH) 组比较，bP < 0.05 图 5 低温对P-GSK3β的影响及LY294002的干预作用 Figure 5 Effect of hypothermia on P-GSK3β and intervention of LY294002 |
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每只兔子的脑皮质取6个视野，计算每只兔子凋亡细胞数量 (40×)，统计分析。结果见表 1。结果示假手术组凋亡细胞数最少，常规复苏组和LY294002组凋亡的细胞数最多，两者比较差异无统计学意义 (P＞0.05)；与常规复苏组及LY294002组比较，复苏即刻降温组和复苏后1 h降温组的凋亡细胞数明显减少，差异有统计学意义 (P＜0.01)。见表 1、图 6。
| 组别 | 只数 | 凋亡细胞数 |
| 假手术组 | 6 | 5.50±2.20 |
| 常温复苏 (NT) 组 | 6 | 54.80±3.30b |
| 复苏即刻降温组 (IATH) | 6 | 28.22±2.74a |
| 复苏后降温组 (PATH) | 6 | 32.03±2.52a |
| LY294002组 | 6 | 49.02±2.84b |
| 注：与常规复苏组 (NT) 比较，aP < 0.05；与复苏即刻降温组 (IATH) 比较，bP < 0.05 | ||
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| A：假手术组；B：常规复苏24 h组；C：复苏后即刻降温24 h组；D：复苏后延迟降温24 h组；E：LY294002 24 h组 图 6 TUNEL法观察各组兔脑神经细胞凋亡情况 (5 μm, ×40) Figure 6 Determination of brainl cell apoptosis in each group by TUNEL (5 μm, ×40) |
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心脏骤停 (CA) 是世界范围内导致死亡和重度残疾的主要原因，据统计每年约一千五百万人死于心源性猝死[5]。脑缺血和自主循环恢复 (ROSC) 后的再灌注可引起严重的脑缺氧损伤，最终导致心脏骤停患者的神经功能障碍。已有随机临床试验证实，低温治疗 (TH, 将中心体温降至32~34 ℃) 对改善ROSC后昏迷的室颤患者的神经功能障碍有效。国际复苏联络委员会指南建议，所有发生过院内或院外骤停的患者入院后需使用低温治疗12~24 h[6-8]。
尽管实验研究从治疗效果上证实了心肺复苏同时启动头部快速降温能改善实验动物的存活率和神经系统功能，但其内源性保护机制还没有深入研究。心肺复苏后脑神经细胞的损伤包括坏死和凋亡。各种生物学行为以及外界的信息传递，都是通过细胞内产生一系列复杂的信号转导和调控实现。近年来，PI3K/Akt信号通路越来越被人们所重视。该信号通路是细胞内接收膜受体信号的重要途径，作为促生存的信号通路，在抑制凋亡维持细胞生存发挥重要作用，尤其是对缺血缺氧-再灌注神经细胞的保护方面[9]。wortmannin和LY294002是PI3K的特异性抑制剂, LY294002因对PI3K的阻断效果更好, 被广泛研究，它通过特异性抑制PI3K110亚单位的催化活性，起到对通路的彻底阻断作用[10]。
本研究结果显示，与对照组比较，常温心肺复苏组后24 h兔脑神经细胞P-Akt表达是降低的，而亚低温心肺复苏组能显著提升复苏后兔神经细胞P-Akt表达 (P < 0.05)，并且复苏时即刻降温比复苏后1 h降温的提升效果更为明显。而Akt抑制剂LY294002对这一作用又起到抑制作用 (P < 0.05)。这一现象提示亚低温抑制了复苏缺血-再灌注引起的Akt脱磷酸化[11]，但具体过程仍不清楚。十几年前国外学者就曾在动物研究中发现，Akt的激活，通过PI3K/Akt信号转导途径，起到抑制心脏和大脑缺血-再灌注损伤后细胞凋亡作用，并且后期的修复过程也有PI3K/Akt信号通路的参与[12-13]。还有研究发现低温能增加Akt、PDKl、FKHR的磷酸化水平，起到神经保护作用，而抑制该通路则脑损伤面积将扩大[12]，抑制脑缺血后大鼠PI3K/Akt的活性也将扩大大脑梗死面积。
糖原合成酶3(GSK-3β) 是一种可参与调控多种细胞功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，GSK-3β受到PI3K/Akt信号转导通路的激活，参与包括代谢、凋亡、基因表达的调节等生理过程。近年来有研究提示磷酸化的GSK-3β又能直接与线粒体膜通道转化孔 (mPTP) 亚单位ANT结合，提高mPTP的开放阈值，阻止mPTP开放而发挥抑制凋亡的作用[14]。本研究通过Western blot的实验方法同样发现，常温心肺复苏后脑神经细胞P-GSK3β表达是下降的，而亚低温能增加复苏后神经细胞P-GSK3β表达 (P < 0.05)，并且复苏时即刻降温比复苏后1 h降温的提升效果更为明显。而降温前注射Akt抑制剂LY294002，又抑制了降温对其表达的影响 (P < 0.05)。
为证明颈部快速降温脑保护是否通过PI3K/Akt/GSK-3β信号通路发挥抑制凋亡的作用，本研究使用LY294002对该通路的激活进行阻断，以验证PI3K/Akt信号通路对心肺复苏后脑神经细胞凋亡的影响。TUNEL结果显示，常温心肺复苏24 h后，兔脑神经细胞凋亡显著增加；复苏即刻颈部降温和复苏后1 h降温均能减少神经细胞凋亡 (P < 0.05)，但降温前LY294002特异性阻断PI3K/Akt/GSK-3β信号通路后，神经细胞凋亡明显增加 (P < 0.05)，以上结果表明，PI3K/Akt/GSK-3β信号通路的激活对复苏后脑神经细胞有抗凋亡作用。阻断该通路，亚低温的抗凋亡作用被削弱，证明颈部快速降温可能是通过PI3K/Akt/GSK-3β通路的激活来起到抑制神经细胞凋亡的作用的。
但是亚低温的脑保护作用是一个多分子多信号参与的复杂级联反应，PI3K/Akt/GSK-3β的下游信号分子很多，LY294002仅阻断了通路的上游，下游级联及其他一些可能参与通路需要进一步研究。
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