中华急诊医学杂志  2017, Vol. 26 Issue (3): 272-277
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刘雪婷, 孙耕耘, 尤青海, 费黎明. RhoA/mDia1参与LPS诱导肺微血管内皮细胞表达p-ERM[J]. 中华急诊医学杂志, 2017, 26(3): 272-277.
Liu Xueting, Sun Gengyun, You Qinghai, Fei Liming. RhoA/mDia1 pathway involved in the expression of p-ERM in the pulmonary micro-vascular endothelial cell induced by lipopolysaccharide[J]. Chin J Emerg Med, 2017, 26(3): 272-277.
RhoA/mDia1参与LPS诱导肺微血管内皮细胞表达p-ERM
刘雪婷, 孙耕耘, 尤青海, 费黎明     
230022 合肥，安徽医科大学第一附属医院呼吸内科
收稿日期: 2016-06-24
基金项目: 国家自然科学基金(81370170，81100053)
*通信作者: 孙耕耘， E-mail:sungengy@126.com.
摘要: 目的 探讨脂多糖(LPS)是否影响大鼠肺微血管内皮细胞(PMVEC)磷酸化埃兹蛋白-根蛋白-膜突蛋白(p-ERM)的表达及与RhoA/mDia1的关系。 方法 于安徽医科大学第一附属医院呼吸内科实验室，取购自安徽省实验动物中心的健康雄性、体质量 100～120 g、SPF级SD大鼠的肺脏，体外培养PMVEC，随机(随机数字法)分为量效组、时效组和干预组( 1 μg/mL RhoA抑制剂(C3 transferase)与PMVEC预孵育240 min再加入10 μg/mL的LPS继续孵育30 min)，Western印迹检测ERM、p-ERM及mDia1表达量。多组变量间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验方法 分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。 结果 PMVEC中均表达ERM、p-ERM及mDia1。量效组p-ERM和mDia1表达随LPS浓度(0、0.1、1、10 μg/mL)增加而升高:p-ERM为(0.520±0.101)、(0.657±0.092)、(0.891±0.167)、(1.227±0.106),0 μg/mL组与0.1μg/mL组比较，P＞0.05,其余P＜0.01;mDia1为(0.200±0.102)、(0.430±0.121)、(0.603±0.154)、(0.887±0.204)，0.1 μg/mL组与1 μg/mL组比较,P＞0.05；其余P＜0.05。时效组p-ERM表达量于15 min开始上升(0.670±0.149)，30 min出现高峰(1.175±0.103)，之后下降,60 min(0.959±0.189),90 min(0.842±0.129),120 min仍持续较高水平(0.767±0.097)，表达量均高于对照组(0.471±0.157)，差异具有统计学意义(15 min组与120 min组比较、60 min组与90 min组比较及90 min组与120 min组比较,P＞0.05；其余P＜0.05)；mDia1表达量于15 min开始上升(0.779±0.035)，30 min达高峰(0.889±0.036),之后下降，60 min(0.648±0.019)，90 min(0.582±0.068),120 min仍持续较高水平(0.526±0.059),均高于对照组(0.284±0.118)，差异有统计学意义(均P＜0.01)。C3 transferase能显著下调LPS诱导的p-ERM的表达 ，mDia1也被C3 transferase抑制 。 结论 LPS诱导大鼠PMVEC内p-ERM表达增加，C3 transferase抑制RhoA/mDia1信号通路后使其表达下调。
关键词: 脂多糖     肺微血管内皮细胞     埃兹蛋白-根蛋白-膜突蛋白     炎症     急性呼吸窘迫综合征     RhoA/mDia1    
RhoA/mDia1 pathway involved in the expression of p-ERM in the pulmonary micro-vascular endothelial cell induced by lipopolysaccharide
Liu Xueting, Sun Gengyun, You Qinghai, Fei Liming     
Department of Respiratory Medicine, The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230022, China
*Corresponding author: Sun Gengyun， E-mail:sungengy@126.com
Abstract: Objective To investigate the possibility of the involvement of RhoA/mDia1 pathway to cause the expression of phosphorylate ezrin-radixin-moesin (p-ERM) in rat pulmonary micro-vascular endothelial cell (PMVEC) after the stimulation of lipopolysaccharide (LPS). Methods The specimens of lung tissue were taken from healthy male SPF grade SD rat with 100-120 g body weight which was purchased from the laboratory animal center of Anhui province. After culture, the PMVECs were randomly divided into dose-dependent groups (0, 0.1, 1, 10 μg/mL LPS added in PMVECs and cultured for 30 min, n=8 in each), time-dependent groups (10 μg/mL LPS added to PMVECs cultured for 0, 15, 30, 60, 120 min, n=8 in each) and intervention group (n=8). In the intervention group, PMVECs were cultured with 1 μg/mL C3 transferase in serum free media for 240 min, followed by treatment with 10 μg/mL LPS for 30 min. Meanwhile, two control groups in serum-free DMEM medium were made by adding 10 μg/mL LPS to PMVECs and 1 μg/mL C3 transferase to PMVECs respectively cultured for 30 min (n=8 in each). Western blot was used to detect the level of p-ERM，ERM and mDia1. Data were analyzed with SPSS 16.0 software, while one way analysis of variance (ANOVA) was used to compare multiple sets of variables, the intergroup comparisons were analyzed by the least-significant-difference (LSD) tests, with P＜0.05 for the statistically significant difference. Results ERM, p-ERM and mDia1 were presented in rat PMVEC. Stimulation with LPS up-regulated p-ERM, mDia1 in a dose-dependent manner: LPS ; and mDia1 . In time-dependent group, the level of p-ERM protein increased at 15 min(0.670±0.149), peaked at 30 min(1.175±0.103), then decreased, at 60 min (0.959±0.189), 90 min (0.842±0.129), but kept at higher level at 120 min(0.767±0.097)than that in control group(0.471±0.157, 15 min group vs. 120 min group,60 min group vs. 90 min group and 90 min group vs. 120 min group, P＞0.05;the rest P＜0.05); and the level of mDia1 increased at 15 min(0.779±0.035), peaked at 30 min(0.889±0.036)then decreased at 60 min (0.648±0.019), 90 min (0.582±0.068), but kept at higher level at 120 min (0.526±0.059) than that in control group(0.284±0.118,all P＜0.01). C3 transferase caused a marked attenuation of LPS induced p-ERM expression , as the same in mDia1 . Conclusion s LPS could up-regulated the expression of p-ERM protein, and inhibition of RhoA/mDia1 signal pathway by C3 transferase could down-regulated the p-ERM levels.
Key words: Lipopolysaccharide     Pulmonary microvascular endothelial cell     Ezrin-Radixin-Moesin     Inflammation     Acute respiratory distress syndrome     RhoA/mDia1    

急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是由感染、创伤等导致的一种急性、进行性呼吸衰竭，其发病机制与肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cell，PMVEC)通透性增加密切相关。多种炎症介质如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、脂多糖(LPS)、白介素-17等均会增加PMVEC通透性[1-2]。而造成ARDS的间接损伤因素中最常见的是脓毒血症[3]。埃兹蛋白-根蛋白-膜突蛋白(Ezrin-Radixin-Moesin，ERM) N末端与膜黏附分子相连接，C末端与肌动蛋白结合位点相结合，因此，ERM蛋白可以作为膜细胞骨架连接器，参与PMVEC通透性调控[4]。RhoA是一种小G蛋白,能调节肌动蛋白细胞骨架应力纤维的形成，其下游效应分子为ROCK(rho-associated kinase)和mDia1(mammalian diaphanous 1)。本课题组既往研究表明TNF-α可经RhoA/ROCK影响PMVEC 内p-ERM蛋白的表达[5]。因此，本实验通过体外培养大鼠PMVEC，用Western印迹法检测LPS诱导大鼠PMVEC内p-ERM表达变化，并初步探讨RhoA/mDia1是否调控PMVEC 内p-ERM表达。

1 材料与方法 1.1 实验动物及主要材料

(1) 动物：健康雄性、体质量 100~120 g、 SPF级SD大鼠，购自安徽省实验动物中心，[合格证号：SCXK(皖)2011-002]。(2) 材料：DMEM高糖培养基干粉及胎牛血清(美国Gibco公司)；兔抗鼠ERM多克隆抗体、兔抗鼠p-ERM多克隆抗体(美国Cell Signal Technology公司)；兔抗鼠mDia1单克隆抗体(英国Abcam公司)；RhoA抑制剂C3 transferase(美国Cytoskeleton公司)；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(武汉博士德生物工程有限公司)；免疫印迹化学发光(ECL)试剂盒(美国Thermo Scientific公司)。

1.2 大鼠PMVEC的分离培养、鉴定与分组

参照本实验室前期建立的方法分离并培养大鼠PMVEC[6]，取SPF级SD大鼠的肺脏，体外培养PMVEC，随机(随机数字法)分为LPS量效组(0、0.1、1、10 μg/mL LPS分别与PMVEC孵育30 min，均n=8)、时效组(10 μg/mL LPS与PMVEC孵育0、15、30、60、90、120 min，均n=8)和干预组(分别以1 μg/mL C3 transferase + 10 μg/mL LPS、1 μg/mL C3 transferase 与PMVEC孵育30 min，同时另设对照组与10 μg/mL LPS单独刺激组，均n=8)

1.3 Western印迹检测ERM、p-ERM及mDia1蛋白

RIPA裂解液与蛋白酶抑制剂PMSF同时加入六孔板内裂解3代大鼠PMVEC 30 min后，收集蛋白。10%分离胶和5%积层胶进行蛋白电泳，蛋白转至硝酸纤维素膜上，用封闭液室温封闭2 h，PBST缓慢洗两次，PBS缓慢洗一次，每次10 min,兔抗鼠ERM多克隆抗体(稀释浓度为1∶800)、兔抗鼠p-ERM多克隆抗体(稀释浓度为1∶1 000)及兔抗鼠mDia1单克隆抗体(稀释浓度为1∶1 000)4 ℃孵育缓慢摇床过夜，次日PBST快速洗两次，PBS快速洗一次，每次10 min,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG溶液(稀释浓度为1∶20 000)室温孵育1 h，PBST快速洗两次，PBS快速洗一次，每次10 min，ECL法显影，扫描存盘,分析灰度值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件分析，计量资料以均数±标准差(x±s) 表示，多组变量间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验方法分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 不同浓度LPS对大鼠PMVEC表达p-ERM蛋白的影响

PMVEC中p-ERM相对表达量随LPS孵育浓度的增加而逐渐升高，其中10 μg/mL的LPS孵育30 min组的p-ERM表达量最高，组间比较差异有统计学意义(F=39.600，0 μg/mL组与0.1 μg/mL组比较，P＞0.05；其余P＜0.01)，见图 1。

与0 μg/mL LPS组比较，aP＜0.01；与0.1 μg/mL LPS组比较,bP＜0.01；与1 μg/mL LPS组比较，cP＜0.01 图 1 不同浓度LPS与PMVEC作用对p-ERM表达的影响 Figure 1 Expression of p-ERM proteins in PMVEC stimulated by different concentrations of LPS
图选项
2.2 不同浓度LPS对大鼠PMVEC内RhoA效应分子mDia1的表达影响

mDia1的表达随LPS浓度的增加而逐渐升高，LPS浓度为10 μg/mL与PMVEC孵育30 min时达最大值，组间差异有统计学意义(F=22.346，0.1 μg/mL组与1 μg/mL组比较,P＞0.05；其余P＜0.05)，见图 2。

与0 μg/mL LPS组比较，aP＜0.05；与0.1 μg/mL LPS组比较，bP＜0.05；与1 μg/mL LPS组比较，cP＜0.05 图 2 不同浓度LPS与PMVEC作用对mDia1表达的影响 Figure 2 Expression of mDia1 protein in PMVEC stimulated by different concentrations of LPS
图选项
2.3 不同时相LPS对大鼠PMVEC表达p-ERM蛋白的影响

10 μg/mL的LPS与PMVEC共同孵育后，ERM蛋白表达无显著变化，p-ERM蛋白相对表达量于15 min开始升高，30 min达高峰，随后下降，但至120 min表达水平仍高于对照组，组间比较差异有统计学意义(F=23.528,15 min 组与120 min 组比较、60 min 组与 90 min组比较、90 min组与120 min组比较,P＞0.05；其余P＜0.05)，见图 3。

与0 min组比较，aP＜0.05；与15 min比较，bP＜0.05；与30 min组比较，cP＜0.05；与60 min组比较，dP＜0.05；与90 min组比较，eP＜0.05；与120 min组比较，fP＜0.05 图 3 LPS与PMVEC作用不同时间对p-ERM表达的影响 Figure 3 Expression of p-ERM proteins in PMVEC at different lengths of time stimulated by LPS
图选项
2.4 不同时相LPS对大鼠PMVEC表达mDia1蛋白的影响

10 μg/mL的LPS与PMVEC共同孵育后，mDia1表达量于15 min升高，30 min达高峰，之后下降，但至120 min表达水平仍高于对照组，组间比较差异有统计学意义(F=177.090，均P＜0.01)，见图 4。

与0 min组比较，aP＜0.01；与15 min组比较，bP＜0.01；与30 min组比较，cP＜0.01；与60 min组比较，dP＜0.01；与90 min组比较，eP＜0.01；与120 min组比较，fP＜0.01 图 4 LPS与PMVEC作用不同时间对mDia1表达的影响 Figure 4 Expression of mDia1 protein in PMVEC at different lengths of time stimulated by LPS
图选项
2.5 RhoA抑制剂(C3 transferase)对LPS诱导PMVEC表达p-ERM蛋白的影响

与对照组比较，10 μg/mL的LPS体外诱导大鼠PMVEC的p-ERM表达显著增高(P＜0.01)；而1 μg/mL的C3 transferase与10 μg/mL的LPS共同孵育30 min后，p-ERM蛋白的相对表达量较10 μg/mL的 LPS单独刺激组显著减少(P=0.01)。RhoA抑制剂单独作用对大鼠PMVEC表达p-ERM无显著影响(与对照组比较，P>0.05)，见图 5。

与对照组比较，aP＜0.01；与C3＋LPS组比较，bP＜0.05；与LPS组比较，cP＜0.01 图 5 C3 transferase对LPS诱导PMVEC中p-ERM表达的干预作用 Figure 5 Intervention effect of C3 transferase on the expression of p-ERM in PMVEC induced by LPS
图选项
2.6 RhoA抑制剂(C3 transferase)对LPS诱导PMVEC表达mDia1蛋白的影响

与对照组比较，10 μg/mL的LPS体外诱导大鼠PMVEC的mDia1表达显著增高(P＜0.01)；而1 μg/mL的C3 transferase与10 μg/mL的LPS共同孵育30 min后，PMVEC内mDia1蛋白的表达量较10 μg/mL的LPS单独刺激组显著减少(P＜0.01)。RhoA抑制剂单独作用对大鼠PMVEC表达mDia1无显著影响(与对照组比较，P>0.05)，见图 6。

与对照组比较，aP＜0.01；与C3＋LPS组比较，bP＜0.01；与LPS组比较，cP＜0.01 图 6 C3 transferase对LPS诱导PMVEC中mDia1表达的干预作用 Figure 6 Intervention effect of C3 transferase on the expression of p-ERM in PMVEC induced by LPS
图选项
3 讨论

多种原因所致的PMVEC损伤引起的肺微血管通透性增加是ARDS发生的关键环节。PMVEC是LPS的主要靶细胞，当LPS作用于PMVEC时，细胞骨架重排，内皮细胞通透性增加[2]。因此，细胞骨架重排与内皮细胞屏障功能有密切联系，研究细胞骨架相关蛋白对ARDS发生机制的探究，防治手段的建立具有重要意义。

ERM蛋白在肿瘤转移及侵袭性方面的研究已经非常广泛，目前对ERM的研究多集中在内皮细胞经不同的刺激因子作用后，其作为调节内皮细胞屏障渗透性的潜在物质调节内皮细胞的通透性。ERM作为肌动蛋白细胞骨架与细胞膜之间的连接者，其功能的发挥与磷酸化有关[7]。例如，Koss等[4]用TNF-α作用于人PMVEC，p-ERM表达增加，同时伴随细胞骨架重构，细胞间隙形成，进而介导内皮细胞通透性增加。但Koss等[4]对ERM蛋白的研究集中在P38-MAPK及PKC信号通路，并未涉及RhoA通路。 本课题组[5]和Zhang等[7]发现RhoA/ROCK信号通路也参与PMVEC内p-ERM蛋白表达增加所致PMVEC通透性增加。 mDia1同为RhoA下游的效应分子，目前尚未见报道PMVEC内RhoA/mDia1信号通路与p-ERM蛋白的相关研究。因此探讨LPS能否引起PMVEC内p-ERM蛋白的表达增加且受RhoA/mDia1信号通路调控对保护PMVEC的屏障功能提供了新的切入点。本研究采用LPS刺激PMVEC，发现p-ERM的表达随LPS刺激浓度增加，其表达量逐渐升高，这与Koss等[4]及本课题组前期研究[5]用不同浓度TNF-α 刺激PMVEC后，p-ERM的表达呈逐渐上升趋势的研究结果一致。

mDia1是一种参与应力纤维形成的成蛋白[8]，在主动脉平滑肌细胞及含有平滑肌细胞的组织如膀胱、肺和食道组织中高表达[9]。在释放血小板的巨核细胞中，mDia1对巨核细胞中的F-肌动蛋白的产生及协助微管的稳定性起到关键作用[10]。但PMVEC内是否有mDia1表达及LPS对其表达量有无影响目前尚未见报道。本实验用Western蛋白印迹实验发现在PMVEC内有mDia1表达。且其表达随LPS的刺激具有一定的浓度和时间依赖性。mDia1的表达量随LPS浓度的增加而升高。10 μg/mL的LPS刺激PMVEC后，mDia1表达量于15 min开始升高，30 min达高峰，然后缓慢下降，但120 min仍高于对照组。有研究用CD3抗体刺激人外周血淋巴细胞，结果显示mDia1表达量较未刺激组明显增加[11]。同时本研究发现在LPS不同时间刺激下，PMVEC内p-ERM的表达趋势与mDia1相同，推测mDia1可能参与LPS致PMVEC内p-ERM蛋白表达变化。Yang等[12]研究表明，LPS破坏肠的屏障功能，且与RhoA/mDia1信号通路有关。

细胞骨架重构是炎症反应和血管损伤引起血管内皮细胞通透性增高的分子基础。RhoA/mDia1信号通路介导应力纤维的形成，并影响细胞肌动蛋白骨架的重排[13-14]。应力纤维诱导内皮细胞收缩，增加内皮细胞的通透性[15]。研究表明，抑制RhoA/ROCK信号通路能显著减少p-ERM蛋白的表达，降低内皮细胞通透性的增加[7]。本实验用RhoA抑制剂预孵育PMVEC 240 min，可明显降低LPS诱导PMVEC内mDia1及p-ERM蛋白表达。提示RhoA/mDia1参与LPS诱导的PMVEC 内p-ERM蛋白的表达变化。其具体机制仍需进一步探讨。但也有研究表明，用RhoA抑制剂(C3 transferase)抑制RhoA，不影响人外周血淋巴细胞中mDia1的表达[11]，或使Caco-2细胞中mDia1表达增加[12]。这种差异的产生可能与组织细胞的异质性有关。

综上，本研究发现大鼠PMVEC内有mDia1蛋白表达，且其表达量的变化与LPS刺激浓度及时间有关。LPS诱导PMVEC内p-ERM蛋白表达增加，RhoA/mDia1使其表达上调。抑制RhoA可显著降低LPS对PMVEC表达p-ERM、 mDia1的刺激效应。因此研究RhoA/mDia1信号通路与ERM蛋白磷酸化的关系可能为今后ARDS的治疗提供潜在的靶点。

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