中华急诊医学杂志  2017, Vol. 26 Issue (2): 191-193
HSP70沉默表达对缺氧状态下SH-SY5Y细胞凋亡的影响及机制研究
谢春雨, 谢伟峰, 李庆淑, 王芸, 宋砚坤, 张楠, 胡丹, 曲彦     
266021 山东省青岛,青岛大学医学部(谢春雨、王芸、宋砚坤、张楠); 266021 山东省青岛,青岛大学医学院附属青岛市立医院重症医学科(谢伟峰、李庆淑、胡丹、曲彦)

缺氧性脑病是人类死亡的重要原因,且发病呈逐年增高的趋势。虽然对缺氧性脑病的研究已涉及多方面,但因其发病机理复杂、部位特殊,仍无理想治疗药物。因此,寻求防治缺氧性脑病的方法已成为刻不容缓的任务。有研究表明,外源性HSP70表达可有效减轻神经元缺氧再复氧损伤的程度[1],但其作用机制尚不明确。本实验采用RNA干扰技术沉默HSP70,观察其对缺氧状态下神经细胞凋亡及BAG-1、Caspase-3、NF-κB表达的影响,进一步探讨HSP70在缺氧性脑病中的保护作用及机制。

1 材料与方法 1.1 细胞培养及靶细胞转染

细胞于含10%胎牛血清,100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的培养基中,置37 ℃、5%CO2培养箱培养。实验分4组,细胞对照组(正常SH-SY5Y细胞)、慢病毒对照组(感染携带GFP编码基因但不含siRNA编码序列的慢病毒)、HSP70-siRNA-Ⅰ感染组(感染携带GFP编码基因及siRNA-Ⅰ编码序列的慢病毒)、HSP70-siRNA-Ⅱ感染组(感染携带GFP编码基因及siRNA-Ⅱ编码序列的慢病毒)。转染前24 h将细胞接种于24孔板中,待细胞汇合度达70%~80%时,按慢病毒操作手册转染细胞。10 h后更换正常培养基,72 h后用嘌呤霉素筛选细胞,得到稳定表达siRNA的细胞系。

1.2 缺血-缺氧细胞模型的建立

将4组生长良好的用无血清低糖培养基培养的细胞置缺氧罐中,37℃培养箱中培养4 h、8 h、12 h后更换正常培养基复氧24 h。

1.3 CCK8法检测细胞增殖情况

将4组对数生长期细胞以5×103/孔接种于96孔板,细胞贴壁后分别缺氧4 h、8 h、12 h,复氧24 h后各孔加10 μL CCK8,用酶标仪检测450 nm处吸光度值。每个时间点每组细胞设6个复孔。

1.4 qRT-PCR检测HSP70、BAG-1 mRNA表达情况

提取缺氧8 h复氧24 h后细胞总RNA,逆转录成cDNA,按qRT-PCR试剂盒说明书进行实验。每个样本设3个复孔,以2-ΔΔCt表示实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数。

1.5 Western blotting检测HSP70、BAG-1、Caspase-3、NF-κB蛋白表达变化

收集缺氧8 h复氧24 h后细胞,提取总蛋白;经电泳、转膜、封闭,一抗4 ℃孵育过夜,孵育二抗后显色拍照。采用Bio-Rad Quantity One软件分析灰度值,确定目的蛋白相对表达量。

1.6 流式细胞仪检测法检测细胞凋亡

收集缺氧8 h复氧24 h后细胞,根据Aneexin V-APC/7-AAD试剂盒说明书双染细胞,流式细胞仪检测凋亡率。

1.7 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行统计分析,数据以均数±标准差(x±s) 表示;4组总体比较采用单因素方差分析,组间比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异具有统计学意义

2 结果 2.1 HSP70沉默对缺氧状态下细胞活性影响

CCK8结果显示,沉默HSP70降低缺氧状态下细胞活力(图 1)。各组细胞的活性随缺氧时间延长均呈先升高后降低趋势,缺氧8 h时细胞活性达高峰,细胞对照组和病毒对照组升高尤为明显(图 2),缺氧8 h时,HSP70-siRNA-Ⅰ和HSP70-siRNA-Ⅱ细胞活性均显著低于细胞对照组及慢病毒对照组(均P < 0.05),细胞对照组与慢病毒对照组细胞活性差异无统计学意义(P>0.05)。

与细胞对照组比较,aP>0.05,与慢病毒对照组比较,bP>0.05 图 1 HSP70沉默对缺氧细胞BAG-1 mRNA转录水平的影响
4组细胞分别缺氧4 h、8 h、12 h后复氧24 h,CCK8检测活力。与细胞对照组缺氧8 h比较,aP<0.05;与慢病毒对照组缺氧8 h比较,bP<0.05;与HSP70-siRNA-Ⅰ缺氧8 h比较,cP<0.05;与HSP70-siRNA-Ⅱ缺氧8 h比较,dP<0.05。缺氧8 h后复氧24 h,与细胞对照组相比,eP<0.05,与慢病毒对照组相比,fP<0.05 图 2 HSP70沉默对缺氧状态下细胞活力影响
2.2 HSP70沉默对缺氧状态下细胞凋亡的影响

4组细胞分别缺氧8 h复氧24 h,采用流式细胞术检测凋亡水平,结果显示,HSP70沉默可加速缺氧细胞凋亡(图 3B)。细胞对照组与慢病毒对照组比较,凋亡率差异无统计学意义(P>0.05);HSP70-siRNA-Ⅰ和HSP70-siRNA-Ⅱ分别与细胞对照组及慢病毒对照组比较,凋亡率差异具有统计学意义(P<0.05)。

缺氧8 h复氧24 h,慢病毒感染组细胞凋亡增加(A),与细胞对照组相比,aP<0.05,与慢病毒对照组相比,bP<0.05 图 3 HSP70沉默对缺氧状态下细胞凋亡的影响
2.3 HSP70沉默对缺氧状态下BAG-1 mRNA、蛋白表达的影响

HSP70沉默对BAG-1 mRNA、蛋白表达水平无明显影响(图 1图 4)。细胞缺氧后BAG-1转录翻译水平两两比较差异无统计学意义(均P>0.05)。

与细胞对照组相比,aP>0.05,与慢病毒对照组相比,bP>0.05 图 4 HSP70沉默对缺氧细胞BAG-1蛋白表达水平的影响
2.4 HSP70沉默对缺氧细胞NF-κB、Caspase-3蛋白表达的影响

HSP70沉默可导致NF-κB、Caspase-3蛋白表达水平升高(图 5B5D)。缺氧8 h后,细胞对照组与慢病毒对照组差异无统计学意义(P>0.05),HSP70-siRNA-Ⅰ和HSP70-siRNA-Ⅱ蛋白表达水平较细胞及慢病毒对照组差异具有统计学意义(均P < 0.05)。

与细胞对照组相比,aP < 0.05,与慢病毒对照组相比,bP < 0.05 图 5 HSP70沉默对缺氧细胞Caspase-3、NF-κB蛋白表达的影响
3 讨论

HSP70在正常细胞中表达水平较低,在应激状态或肿瘤细胞中表达增加。已有文献证实HSP70对脑缺血损伤有保护作用,高表达HSP70可保护神经元免受缺血损伤,而HSP70敲除后神经元对缺血损伤更加敏感[2-6]。本研究通过沉默HSP70,发现细胞对缺氧的敏感性增加,在缺氧状态下细胞活性下降,凋亡率增高,说明HSP70降低可加剧缺氧对细胞的损伤。

NF-κB主要涉及机体防御反应、组织损伤和应激、细胞分化和凋亡以及肿瘤生长抑制过程的信息传递[7-11]。有研究表明,上调HSP70可抑制NF-κB激活,下调HSP70可激活NF-κB活性[12-13]。本研究结果显示,沉默HSP70后,NF-κB蛋白表达水平升高,提示HSP70沉默可能增加NF-κB核转录活性,从而导致细胞凋亡。

Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶。有研究发现,HSP70通过调节Caspase-3活性而发挥抗凋亡作用[14-17]。HSP70沉默后Caspase-3表达上调,提示HSP70沉默可能通过激活Caspase-3而促进细胞凋亡。这与吴思荣等[18]和周海燕等[19]的研究结果一致。

BAG-1在许多肿瘤细胞中都有抗凋亡作用[20-22]。其抗凋亡作用与C-末端功能域密切相关,该结构域与HSP70 ATP酶结构域相结合,发挥神经保护功能[23-24]。HSP70沉默后BAG-1 mRNA转录及蛋白表达水平均无明显变化,说明HSP70抗凋亡作用可能与BAG-1无明显相关性。

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