2017, Vol. 26
失血性休克(hemorrhagic shock，HS) 患者出现自发性低体温是预后不良的标志，但动物实验研究发现诱导性低温(inducible hypothermia，IH) 却可以明显改善HS的预后[1-4]。虽然IH治疗HS的机理至今尚未完全阐明，但已有研究显示IH可通过降低机体代谢率、增加能量储备等方式减少能量损耗，进而提高复苏效率[1-4]。在这一能量调控过程中必然有诸多能量代谢调控基因参与调解，过氧化物酶体增殖物激活受体γ协同刺激因子(peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator-1，PGC-1) 和微小异源二聚体伴侣(small heterodimer partner，SHP) 是参与能量代谢调控的重要基因[5-6]，HS复苏过程中采用IH对其有何影响，目前尚无研究报告。笔者对其变化规律进行研究，目的在于为后期的基因调控治疗奠定基础。
1 材料与方法 1.1 实验材料成年SD大鼠(第三军医大学动物实验中心)。Datex-Ohmeda S/5多功能监护仪(芬兰德恩公司)；压力传感器(新加坡Biosensors International PET. Ltd)；PCR扩增仪(德国Biometra)；PE-50管(美国Sigma公司)；紫外分光光度计(英国UV-visible Spectrometer, UV300)；高速冷冻离心机(美国Sigma公司)；微量输液泵(浙大医学器械有限公司WZ-50cz)；Bayer Rapidlab 865型血气分析仪(德国Bayer公司)。
RNA固定液(北京天恩泽基因科技有限公司)；荧光定量PCR试剂盒(大连宝生物工程大连有限公司)；肝素钠(天津生物化学制药有限公司)。PGC-1和SHP引物合成(大连宝生物工程大连有限公司)。PGC-1(sc-13067) 和SHP (sc-15283) 抗体购于SANTA CRUZ公司。
1.2 动物准备SD大鼠(300~350 g) 雌雄不拘，实验前12 h禁食，自由饮水。以戊巴比妥那(60 mg/kg) 腹腔内注射麻醉成功后，进行气管内插管和小动物呼吸机辅助呼吸，潮气量设定为7~8 mL/kg，呼吸频率设定为80次/min，吸入氧体积分数为40%。分离出左侧股动脉及股静脉，插管(PE-50) 后分别用于放血和复苏时液体回输，右侧颈动脉插管用于监测平均动脉压(MAP)。外科操作结束后，待大鼠稳定10 min后再开始下一步实验。
1.3 失血性休克复苏模型建立采用定容性失血性休克模型，通过股动脉在15 min内匀速将40%的血容量(按25 mL/kg体质量计算) 放出，放血速度为0.5 mL/min。抽出的血液储存在肝素化的(7.5 U/mL) 无菌注射器内，储存于4 ℃冰箱中，待复苏时回输至大鼠体内。放血后分别通过体外加温及体表降温的方法维持大鼠直肠温度在32 ℃和38 ℃，低血压维持时间为60 min。休克60 min后用输液泵回输放出的血和2倍放血量的乳酸林格液进行复苏，复苏期维持60 min。复苏结束后恢复大鼠体温到38 ℃，监测血流动力学3 h。
1.4 动物分组40只大鼠随机(随机数字法) 分为3组：(1) 对照组(C)(n=8)：只麻醉、置管，不建立模型；(2) 低温组(H)(n=16)：模型建立后调整直肠温度到32 ℃；(3) 常温组(N)(n=16)：模型建立后维持直肠温度在38 ℃。H组和N组分别在复苏结束3 h后处死一批大鼠(n=8)，取肝脏组织检测，剩余大鼠用于72 h生存分析。
1.5 定量PCR法检测PGC-1和SHP mRNARNA提取：TRIzol一步法提取RNA。反转录：采用TaKaRa公司试剂盒合成cDNA，反应条件：37 ℃，15min；85 ℃，5 sec。PCR扩增：PGC-1引物序列：上游5’ -CAGCCCTCTTCATCTCCAAG -3’，下游5’ -TCGTGCAGGTCATCAAGAAG -3’；SHP引物序列：上游5’ -TCAACATCTCCGATGACAGG-3’，下游5’ -ACGCATACCTGAAAGGCACTt-3’；β-actin引物序列：上游5’ -TCATCACCATTGGCAATGAG-3’，下游5'-CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3’。PCR反应按下列条件循环：95 ℃、0.5 min，预变性，然后95 ℃、30 s，60 ℃、34 s，进行40个循环后，60 ℃1 min延伸。根据标准曲线，荧光定量PCR仪自动分析并计算结果，按2-△△CT法计算mRNA在实验组和正常组中表达的相对水平。
1.6 Western Blot法检测PGC-1和SHP蛋白肝组织加入5倍体积预冷的细胞裂解液，冰浴下匀浆，再用冰水浴超声粉碎。4 ℃、12 000 r/min，离心1 h取上清液，考马斯亮蓝法进行蛋白定量。SDS-PAGE分离样品(40 μg) 后电转移至硝酸纤维膜上，封闭后，加入一抗(PGC-1，1:500；SHP，1:1 000) 室温下免疫沉淀1 h，摇洗后加入标记二抗(1:2 000)，室温下作用2 h。ECL浸膜，显影。照片在图像分析仪上进行分析定量，记录相应蛋白条带的平均光强度值，并计算PGC-1、SHP和actin吸光度值的比值。
1.7 生化检测指标模型建立前(HST 0 min)、模型建立后(HST 90 min)、复苏后(HST 150 min) 及复温后(HST 330 min) 分别检测血细胞压积(Hct)、乳酸(Lac)、剩余碱(BE) 和血糖(Glu)。
1.8 统计学方法计量资料均以均数±标准差(x±s) 表示，采用单因素方差分析或成组t检验进行分析，生存分析采用Kaplan-Meier法，经SPSS 11.0统计分析软件处理完成。以P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 生化指标两组Hct在建模后都明显下降，复苏后均略有恢复，两组在模型建立前后的各个时间点间差异均无统计学意义(P＞0.05)。常温组和低温组BH值在建模后分别从(-3.2±1.1) vs. (-2.9±1.3) 下降到HST 90 min的(-7.4±3.3)vs.(-7.1±2.1)，两组间差异无统计学意义；但复苏后(HST 150 min) 低温组的的BE值上升明显，为(-4.7±2.5)，与常温组(-9.0±3.2) 相比，差异无统计学意义(P < 0.05)；HST 330 min虽然两组BE值均略有升高，但差异无统计学意义。两组乳酸水平在建模后分别从(0.9±0.2) vs. (1.1±0.4) 上升到HST 90 min的(8.3±1.8) vs.(7.4±1.7)，两组间差异无统计学意义；复苏后(HST 150 min) 低温组的的乳酸值略有下降(6.3±2.1)，而常温组却明显上升(10.4±1.5)，两组差异具有统计学意义(P < 0.05)；HST 330 min两组乳酸值的反向变化更为明显，差异具有统计学意义。两组血糖的变化在模型建立前后的各个时间点间差异无统计学意义(P>0.05)。见表 1。
| 指标 | HST 0 min | HST 90 min | HST 150 min | HST 330 min |
| Hct (%) | ||||
| 常温组 | 33±5 | 27±2 | 23±4 | 22±3 |
| 低温组 | 33±3 | 26±5 | 22±5 | 21±3 |
| BE (nmol/L) | ||||
| 常温组 | -3.2±1.1 | -7.4±3.3 | -9.0±3.2 | -7.5±3.6 |
| 低温组 | -2.9±1.3 | -7.1±2.1 | -4.7±2.5a | -3.8±1.7a |
| Lac (mmol/L) | ||||
| 常温组 | 0.9±0.2 | 8.3±1.8 | 10.4±1.5 | 11.5±1.7 |
| 低温组 | 1.1±0.4 | 7.4±1.7 | 6.3±2.1a | 4.9±1.8a |
| Glu (mg/dL) | ||||
| 常温组 | 322±32 | 416±15 | 260±16 | 116±11 |
| 低温组 | 310±30 | 443±28 | 277±27 | 122±14 |
| 注：与低温组比较，aP < 0.05 | ||||
对照组大鼠肝脏组织内可见PGC-1和SHP mRNA表达，复苏结束3 h后常温组大鼠的PGC-1 mRNA表达明显升高，是对照组的(6.2±0.6) 倍(P < 0.01)；低温组大鼠的PGC-1 mRNA表达明显减少，是对照组的(-2.2±0.4) 倍(P < 0.01)。与PGC-1 mRNA表达情况不同，SHP mRNA的表达呈逐步升高的趋势：常温组大鼠的SHP mRNA表达明显升高，是对照组的(2.3±0.9) 倍(P < 0.01)，低温组大鼠的SHP mRNA表达进一步升高，是对照组的(7.4±1.3) 倍(P < 0.01)。见图 1。
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| 两个mRNAN组与H组均差异有统计学意义P < 0.05 图 1 PGC-1和SHP mRNA表达变化 Figure 1 Expression of PGC-1 and SHP mRNA |
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对照组大鼠肝脏组织内可见PGC-1和SHP蛋白的基础表达，复苏结束3 h后常温组大鼠的PGC-1蛋白表达明显减少，从基础状态的(0.39±0.13) 减少到(0.24±0.12)，低温组大鼠的PGC-1蛋白表达减少得更多，为(0.18±0.11)(P < 0.05)。与PGC-1蛋白表达情况相反，SHP蛋白的表达呈逐步升高的趋势：常温组大鼠的SHP蛋白表达明显升高，从基础状态的(0.22±0.11) 升高到(0.55±0.15)，低温组大鼠的SHP蛋白表达增加得更多，为(1.02±0.21)(P < 0.01)。见图 2。
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| 图 2 PGC-1和SHP蛋白表达变化 Figure 2 Expression of PGC-1 and SHP protein |
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两组大鼠在休克期及复苏期均无死亡，常温组大鼠4只存活到72 h，低温组大鼠7只存活到72 h，Kaplan-Meier生存分析显示常温组与低温组差异具有统计学意义(Log-rank检验P < 0.05)。
3 讨论创伤及HS患者非常容易出现自发性低体温，低体温可以对心、肝、肾、凝血、免疫等功能及酸碱平衡产生重要影响，严重时甚至可以导致“致死三联征”的出现[7-8]。既往研究证实，患者出现自发性低体温是预后不良的标志。低温持续时间超过4 h，病死率达40%；核心温度低于32℃，病死率达100%[9]。相反有计划的治疗性低温或IH却对失血性休克的治疗大有裨益，这为众多研究所证实。研究显示IH非但没有影响HS时的凝血机能和血流动力学稳定，相反明显提高了复苏效率[10]。而且IH还可以明显改善HS引起的炎症反应、增强机体的免疫功能、调整能量代谢平衡，因而可以改善HS的预后[11]。
在IH治疗HS的众多机制中，调整能量代谢平衡是其中非常重要的一环。已有研究发现IH可增加线粒体合成、保护ATP酶活性、降低组织细胞能量消耗并增加糖酵解的敏感性，因而能维持HS时能量代谢处于平衡状态[12]。但IH如何在分子水平实现的这一目标，目前相关研究较少，PGC-1和SHP因在能量代谢调控中具有重要作用而被重视。
PGC-1能停靠多种转录因子，增强靶基因转录效率，广泛参与多种代谢通路的调节活动，在适应性产热、线粒体生成、脂肪酸的β氧化及肝糖异生等过程中有着重要作用[5, 13]。SHP蛋白由256个氨基酸组成，编码的蛋白产物是核受体超家族的成员之一，与类维生素A受体、甲状腺激素受体、性激素受体、肾上腺皮质激素受体、肝细胞核因子受体等多种代谢相关受体相作用并抑制其转录活性，同时还参与胆固醇代谢[6, 14]。在调控能量代谢的效果上两个基因的作用是相反的，PGC-1可以促进能量代谢，SHP抑制能量代谢。
李伟文等[15]等研究发现失血性休克大鼠肠上皮细胞内PGC-1蛋白和mRNA的表达均呈现早期增高，后期显著降低的趋势。分析其原因，早期PGC-1 mRNA和蛋白合成增多可能与细胞能量供给不足导致适应性的线粒体合成增加、能量代谢增强有关；而后期PGC-1 mRNA和蛋白表达下降，一方面是PGC-1在翻译和转录水平的表达受抑制的结果，另一方面也是能量代谢调控失衡或衰竭的表现。对于SHP在HS过程中的变化规律，目前国内外尚无研究报告。
本研究发现，常温复苏3 h后PGC-1和SHP的mRNA表达均明显增加增加，但低温复苏3 h后PGC-1和SHP的mRNA表现出不同的变化趋势：SHP的mRNA表达继续显著增加，但PGC-1的mRNA表达明显减少。常温复苏后PGC-1的mRNA表达增加应该是机体对创伤后能量供给不足的一种适应性反应，而SHP的mRNA表达升高则是机体对PGC-1 mRNA表达增加的一种平衡反应(抑制效应)。低温复苏后代谢性酸中毒明显改善这是IH降低机体代谢率的结果，而PGC-1 mRNA表达下调和SHP mRNA表达继续上调是机体对代谢率降低这一变化从分子水平做出的适应性调节。低温复苏后两种基因蛋白表达的趋势与mRNA的变化趋势相同，这进一步证实了IH是通过PGC-1和SHP等作用相反的两类代谢调控基因调节代谢反应的。调控的结果必然是机体能量损耗减少，能量储备增加，HS的复苏效能改善。本研究发现，常温复苏3 h后PGC-1的蛋白表达出现下降趋势，这一现象与李伟文等[15]的研究发现相似。这应该是机体能量代谢调控失控的表现，与低温复苏后出现的适应性表达下降是有本质区别的。
本研究从能量代谢角度出发，在分子水平探讨了IH治疗HS的机理，为进一步阐明IH的治疗机制奠定了基础。
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