2017, Vol. 26
机械通气和氧疗是治疗呼吸衰竭的主要手段，但长时间吸入高浓度氧气会产生大量氧自由基(ROS)，诱发炎症效应，促进细胞凋亡，从而进一步加重肺损伤，称为高氧诱导的急性肺损伤(HALI)[1]。核因子-кB (NF-кB) 是一种核转录因子，参与多种炎症细胞因子的调控，在急性肺损伤的发病中扮演着重要角色[2]。Bruton酪氨酸激酶(Btk) 是Tec家族的一种非受体型酪氨酸激酶，在炎症过程中不但可触发下游炎症因子的产生和释放，还可调控凋亡蛋白的活性及ROS的产生[3-4]。然而，Btk在HALI中有何作用，与NF-кB有何关系目前尚不清楚。本研究通过建立小鼠高氧肺损伤模型，测定其肺组织Btk、p-Btk、pNF-кB p65和白细胞介素-6(IL-6) 表达水平以及血清单核细胞趋化因子-1(MCP-1) 含量，以期探讨Btk与NF-кB在HALI发生过程中的相互关系及作用机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物分组及模型建立健康雄性昆明小鼠72只，8~12周龄，体质量15~20 g (山西医科大学实验动物中心提供)，随机数字法分为4组：对照组、高氧暴露3天组(H3d组)、抑制剂组和高氧暴露3 d+抑制剂组(H3d+I组)，每组18只。对照组呼吸室内空气；H3d组置于氧气舱内吸入高浓度氧，内置测氧仪(沃赛特科技DR70c-O2) 持续检测舱内氧体积分数(95%左右)；抑制剂组给予腹腔注射Btk特异性抑制剂LFM-A13(50 mg/kg)，每12 h重复给药一次；H3d+I组同时给予上述两种干预措施，即腹腔注射LFM-A13后置于氧气舱内吸入高浓度氧。各组小鼠实施干预后，均以1%戊巴比妥钠(40 mg/kg) 腹腔注射麻醉，按实验设计留取血液、支气管肺泡灌洗液(BALF) 和肺组织样本，处置方法符合动物伦理学标准。
1.2 主要试剂和仪器LFM-A13(美国selleck公司)；蛋白定量试剂盒(Bicinchoninic acid，BCA，武汉博士德)；兔抗鼠Btk一抗和鼠抗鼠pNF-кB p65一抗(美国CST公司)；兔抗鼠pBtk一抗(美国Abcam公司)；TRIzolRNA提取液(美国Life公司)；逆转录试剂盒和Syber Green (日本Takara公司)；MCP-1酶联免疫吸附试剂盒(中国Eliabscience公司)；qPCR仪(美国ABI公司)。
1.3 肺损伤程度评估肺组织损伤程度按以下方法进行评估。①肺湿/干质量比值(W/D)：小鼠处死后立即取右肺，吸干表面血迹后称湿质量，然后置入60℃烤箱中过夜再称干质量，计算肺组织湿/干质量比值。②支气管肺泡灌洗液(BALF) 蛋白浓度测定：采用BCA法测定BALF中总蛋白含量，操作按试剂盒中说明进行。③病理学评分：采用Andreas盲法评分[5]，即根据间质水肿、肺泡水肿，中性粒细胞渗出，实质出血及血管旁-支气管周出血等5个独立指标进行评分，分为4个等级：0肺无异常；1轻度；2中度；3重度。
1.4 肺组织Btk、pBtk及pNF-кB p65蛋白表达测定采用Western blot法测定肺组织Btk、pBtk及pNF-кB p65蛋白表达水平，测定方法按试剂盒说明进行。同时检测β-actin的表达作为内参照。应用Alpha view SA软件进行结果分析，以目的蛋白条带/内参蛋白条带的灰度值作为该蛋白的相对表达水平。
1.5 肺组织IL-6 mRNA表达水平测定取等量肺组织加入TRIzol以提取RNA，经逆转录成cDNA后的用于qPCR，操作步骤严格按试剂盒说明书进行。引物设计参照Genebank，目的基因序列编码区采用Primer Premier 5.0软件完成，由Takara公司合成。目的基因IL-6的引物序列为F:5’ -GTGGCAGGTAGAGCAGGAAG-3’；R:5’ -CCAAATGAAAGGCACTCTGT-3’。内参基因β-actin的引物序列为F:5’ -CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3’；R:5’ -ATGGAGCCACCGATCCACA-3’。反应体系20 μL：2×SYBR Green qPCR Master mix (High Rox)10 μL，目的cDNA模板:1 μL，5 μnol/L的上下游引物各1.6 μL，dH2O:6.4 μL；扩增条件：50 ℃ 2 min, 95 ℃ 10 min, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 反应40个循环，反应程序由ABI-7300系统执行。
1.6 血清MCP-1含量测定采用酶联免疫吸附试验(ELISA法) 测定血清MCP-1含量。操作步骤严格按试剂盒说明书进行。酶标仪设定的吸光度值为450 nm，绘制标准曲线，根据测得的样本吸光度值在标准曲线上查找相应的样本浓度值。
1.7 统计学方法采用GraphPad prism 6.01软件对实验数据进行分析。所有数据均数±标准差(x±s) 表示，多组间比较采用方差分析，两组间差异比较采用成组t检验，均数间两两比较采用SNK-q法，相关性分析采用Partial相关分析法，以P < 0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 肺组织病理学改变HE染色光镜下观察，对照组与抑制剂组小鼠肺泡结构完整，肺泡间隔无明显增厚、水肿和炎症细胞浸润，Andreas评分 < 1；H3d组肺泡结构破坏明显，肺泡及间质水肿伴大量炎症细胞浸润，Andreas评分=8；H3d+I组较H3d肺组织病理损伤明显减轻，炎症细胞浸润减少，Andreas评分=3。见图 1。
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| A:对照组肺组织结构完整，无炎症细胞浸润；B:H3d组肺泡结构明显塌陷，大量炎症细胞浸润；C:H3d+I组肺间质轻度水肿，炎症细胞浸润减少；D:抑制剂组肺泡形态正常，无明显炎症细胞浸润 图 1 光镜下HE染色的各组肺组织切片(×400) Figure 1 HE staining of lung tissue sections of each group under light microscope (×400) |
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各组小鼠肺组织W/D比值和BALF总蛋白(TP) 含量测定结果见表 1。结果显示，H3d组小鼠肺组织W/D比值和BALF中TP含量均明显高于对照组、抑制剂组和H3d+I组，差异具有统计学意义(分别为F=122.838, F=104.436, F=51.324, 均P < 0.01和F=149.165，F=152.70，F=26.022，均P < 0.01)。
| 组别 | W/D比值 | TP (g/L) |
| 对照组 | 3.380±0.19 | 0.033±0.007 |
| H3d组 | 5.808±0.452a | 0.349±0.057a |
| H3d+I组 | 4.030±0.323b | 0.194±0.037bc |
| 抑制剂组 | 3.378±0.028 | 0.028±0.009 |
| 注：与对照组比较, aP < 0.01，cP < 0.05；与H3d组比较，bP < 0.01 | ||
各组小鼠肺组织Btk、p-Btk和pNF-кBp65蛋白半定量测定结果见图 2。结果显示，对照组和抑制剂组肺组织几乎无pNF-кBp65蛋白表达，仅有少量Btk蛋白表达。H3d组肺组织Btk、p-Btk和pNF-кBp65蛋白表达水平均明显高于对照组(F=186.386;F=1 487.410;F=183.719, 均P < 0.01) 和抑制剂组(F=213.301；F=1 686.422；F=173.547, 均P < 0.01)；H3d+I组肺组织Btk、p-Btk和pNF-кBp65蛋白表达水平虽高于对照组和抑制剂组，但明显低于H3d组(F=95.282, F=893.986, F=126.298;均P < 0.01)。Partial相关分析表明，各组小鼠肺组织中Btk和p-Btk与pNF-кBp65蛋白表达量之间呈正相关(r=0.902, r=0.954，均P＜0.01)。
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| 与对照组比较, aP < 0.01，与H3d组比较，bP < 0.01 图 2 Western blot法检测各组小鼠肺组织中Btk、p-Btk、pNF-кBp65的蛋白表达况 Figure 2 The expression level of Btk、phospho-Btk and p-NF-кB in the different group lung tissues of mice were detected by western blot |
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各组小鼠肺组织IL-6 mRNA表达水平见图 3。结果显示，H3d组肺组织IL-6 mRNA的表达量均明显高于对照组和抑制剂组(F=131.853;F=139.822, 均P < 0.01)；H3d+I组肺组织IL-6 mRNA的表达量虽高于对照组和抑制剂组，但明显低于H3d组(F=58.556，P < 0.01)；对照组和抑制剂组比较差异无统计学意义(F=1.063，P＞0.05)。
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| 与对照组比较，aP < 0.01，bP < 0.05；与H3d组比较，cP < 0.01 图 3 RT-qPCR法检测肺组织中IL-6 mRNA在各组间的表达水平 Figure 3 The expression level ofIL-6 mRNA in the different group lung tissues of mice were detected by RT-qPCR |
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各组小鼠血清MCP-1含量测定结果显示，H3d组血清MCP-1含量均明显高于对照组和抑制剂组[(476.70±84.25) pg/mL vs.(71.33±15.61) pg/mL, F=111.88；(476.70±84.25) pg/mL vs.(62.50±13.08) pg/mL，F=114.424，均P < 0.01]；H3d+I组血清MCP-1含量虽高于对照组和抑制剂组，但明显低于H3d组[(183.50±24.38) pg/mL vs.(476.70±84.25) pg/mL，F=58.374，P < 0.01]。对照组和抑制剂组比较差异无统计学意义[(71.33±15.61) pg/mL vs.(62.5±13.08) pg/mL, F=0.291，P=0.6]。
3 讨论ALI/ARDS是目前临床上常见的急危重症，氧疗是其在临床救治过程中不可替代的最基础治疗手段[6]。但高浓度氧疗引发肺组织氧化应激损伤也是不可忽视的并发症。本实验结果显示，95%体积分数高氧暴露3天即可引起小鼠肺泡结构重塑，肺间质水肿，炎症细胞浸润等一系列病理改变，称高氧诱导的急性肺损伤(HALI)。有证据表明，除氧化应激外，炎症细胞和细胞因子也参与了HALI的发病过程[7-8]，但具体作用机制有待进一步阐明。
NF-кB是一种核转录因子，包含5个亚基，即P50、P52、P65、c-Rel和RelB。在稳定状态下，NF-кB位于胞浆中与IкB相结合处于失活状态。在LPS、高浓度氧及大潮气量机械通气等因素刺激下，IкB发生泛素化而与NF-кB解离，后者活化后移位至胞核内特定位点，从而调控靶基因的转录。研究表明，NF-кB活化在HALI发生中扮演着重要角色，可调控多种细胞因子和炎症介质的释放，形成瀑布效应而引起肺组织损伤[9], 其中包括IL-6、MCP-1等[10]。在前期研究中发现，高氧环境下肺组织NF-кB表达量与高氧暴露时间长短有密切关系[11]。本实验结果显示，H3d组肺组织损伤程度、pNF-кB p65表达量、IL-6 mRNA表达量及血清MCP-1含量均明显高于对照组, 提示高氧暴露可促使NF-кB发生活化，上调IL-6和MCP-1等炎症因子表达，是导致肺组织炎症性损伤的重要原因。然而，高氧暴露究竟通过哪条细胞内信号转导通路激活NF-кB目前尚不清楚。
Btk是一种非受体型酪氨酸激酶，几乎表达于除T细胞之外的所有髓系细胞中，属于Tec家族，包含5个成员，即Btk、Itk、Tec、Bmx和Txk。从结构上看，Btk由PH、TH、SH3、SH2及Src等结构域组成，这些结构域关联着许多细胞内的信号蛋白，在炎症反应、免疫反应和氧化应激中扮演着重要角色[3]。Zhou等[12]采用盲肠结扎穿刺术诱发脓毒症造成小鼠ALI模型，通过SiRNA干扰技术下调Btk表达后发现，肺组织损伤程度较对照组明显减轻。Krupa等[13]用脂多糖和免疫复合物(LPS/IC) 联合诱导小鼠发生ALI，同样采用SiRNA干扰技术抑制肺组织中性粒细胞Btk的表达。结果发现，肺组织中性粒细胞募集数量明显减少。本研究结果显示，在高氧诱导的小鼠ALI模型中采用Btk特异性抑制剂LFM-A13进行干预后，肺组织病理损伤程度、BALF总蛋白含量和W/D比值均明显降低。提示，肺组织Btk高表达是HALI发生的重要原因，抑制Btk表达可有效改善高氧肺损伤的程度，发挥保护性效应。
研究表明，Btk可调控细胞内多种关键信号转导蛋白的活性，包括NF-кB、NFAT、PKC、Pin1、TLRs和caveolin-1等，其中以NF-кB信号导通路最为重要[14-15]。Petro等[16]通过体外基因干扰实验证明，在BCR受体信号通路中Btk对于NF-кB的活化具有关键作用，敲除Btk基因表达可使NF-кB活性降低。Liang等[17]进一步通过水动力转染技术进行在体动物实验，并提出一种细胞内信号转导通路假想模式：BCR受刺激后，Btk位移至细胞膜脂筏与小窝蛋白(Caveolin) 等构成多蛋白复合物。在这个复合物结构中，Btk发生磷酸化而导致NF-кB活化，后者的亚单位P65/RelA进入细胞核并结合在Btk启动子上，从而调控其基因转录，新合成的Btk可进一步活化NF-кB，从而形成一个正反馈环路。本研究结果显示，H3d+I组肺组织Btk、p-Btk和pNF-кB p65表达量较H3d组明显降低，且肺组织Btk和p-Btk表a达水平与pNF-кB p65表达量之间均呈正相关。说明在高氧肺损伤发生过程中，Btk可能是通过激活NF-кB发挥作用的。因此笔者推测，氧化应激促使ROS (如O2-、H202、HO-等) 大量释放，激活膜受体信号蛋白，通过接头蛋白(如MyD88、Mal、TRIF等) 使Btk转移至胞膜，后者与Caveolin-1结合后发生活化，进而激活NF-кB，诱导IL-6和MCP-1等炎症因子释放，最终导致肺组织炎症性损伤。
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