中华急诊医学杂志  2017, Vol. 26 Issue (2): 161-167
生长停滞特异性蛋白6对脓毒症小鼠急性肺损伤的保护研究
卞佳兰, 莫清飞, 罗欢, 田昕, 胡志强, 陈伟, 卢中秋, 邱俏檬, 赵光举     
浙江省温州,温州医科大学附属第一医院急诊医学中心(卞佳兰、莫清飞、罗欢、胡志强、陈伟、卢中秋、邱俏檬、赵光举);浙江省温州,温州医科大学附属第五医院急诊科(田昕)
摘要: 目的 研究生长停滞特异性蛋白6(Gas6) 对脓毒症急性肺损伤小鼠的保护作用,并探讨其作用机制。 方法 取90只BALB/c雄性小鼠,按随机数字表法分为假手术组、脓毒症组、脓毒症+生理盐水组、脓毒症+Gas6干预(1 μg) 组、脓毒症+Gas6干预(5 μg) 组、脓毒症+Gas6干预(10 μg) 组,每组15只。脓毒症和脓毒症+Gas6干预组行盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture, CLP),Gas6干预组术后立即尾静脉注射Gas6。假手术组仅行开腹,不予以结扎穿孔。术后24 h收集血液,酶联免疫吸附法(ELISA) 检测血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β) 水平;处死小鼠,留取肺组织,测定肺组织湿/干质量比值(W/D);观察肺组织病理学改变,计算肺组织病理评分;蛋白免疫印迹法(Western blotting) 检测肺组织胞核NF-κB p65及胞浆IκB-α蛋白表达。统计学方法采用SPSS 23.0统计软件,两组样本比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析检验。 结果 与假手术组相比较,脓毒症组小鼠血清TNF-α(P=0.000)、IL-1β(P=0.000)、肺组织湿/干重比值(W/D)(P=0.000)、肺组织病理评分(P=0.000)、肺组织胞核NF-κB p65蛋白含量(P=0.006) 的表达均增加,而肺组织胞浆IκB-α(P=0.001) 表达明显下降。与脓毒症+生理盐水组相比,脓毒症+Gas6(1、5、10 μg) 组小鼠24 h后血清中TNF-α(P=0.000)、IL-1β(P=0.000)、肺W/D (P=0.000)、肺组织病理评分(P=0.000)、肺组织胞核NF-κB p65蛋白含量(P=0.000) 的表达水平降低,而胞浆IκB-α(P=0.009) 表达水平明显上升并呈一定的剂量依赖关系。 结论 Gas6能够有效减轻脓毒症所致的肺损伤,其分子作用机制可能与抑制炎性反应以及下调NF-κB p65胞核内转位有关。
关键词: 生长停滞特异基因6     脓毒症     小鼠     急性肺损伤     炎症因子     干扰素-α     白细胞介素-1β     核因子-κB     IκB-α    
Protective effects of GAS6 on acute lung injury in septic mice
Bian Jialan, Mo Qingfei, Luo Huan, Tian Xin, Hu Zhiqiang, Chen Wei, Lu Zhongqiu, Qiu Qiaomeng, Zhao Guangju     
Emergency Department, The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, China (Bian JL, Mo QF, Luo H, Hu ZQ, Chen W, Lu ZQ, Qiu QM, Zhao GJ) Emergency Department, The Fifth Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, China (Tian X)
*Corresponding author: Qiu Qiaomeng, E-mail:qqm@wzhospital.cn; Zhao Guangju, E-mail:zgj_0523@126.com
Abstract: Objective To explore the protective effect of GAS6 (growth arrest-specific gene 6 protein) on lung injury in septic mice so as to elucidate the mechanism. Methods Ninty male BALB/c mice were divided into 6 groups (n=15):sham operation group, CLP group, CLP+vehicle group, CLP+GAS6 group (1 μg), CLP+GAS6 group (5 μg), CLP+GAS6 group (10 μg).Mice in CLP groups and GAS6 groups were made to be sepsis models by CLP. GAS6 was administrated after CLP in GAS6 groups by intravenous injection. And mice in sham group were only treated with laparotomy without CLP. And 24 h later, all survived mice were sacrificed to obtain blood and lung tissue. Serum levels of TNF-α, IL-1β were measured by using ELISA. The lung wet/dry ratio was calculated. Histopathological changes of lung tissues were observed under light microscope. NF-κB and IκB-α were assayed by Western blotting. Data were analyzed by SPSS 23.0. Statistical analyses were performed using independent sample t-test to compare between two groups or one-way analysis of variance test to compare among multiple groups. Results The serum levels of TNF-α (P=0.000), IL-1β (P=0.000), the lung W/D (P=0.000), pulmonary pathological change (P=0.000), the levels of NF-κB (P=0.006) in CLP group were higher than those in sham group, while IκB-α (P=0.001) in CLP groups was lower than those in sham group. The GAS6 significantly reduced the serum levels of TNF-α (P=0.000), IL-1β (P=0.000), the lung W/D (P=0.000), pathogenesis of lung tissue (P=0.000) and the levels of NF-κB (P=0.000) in septic mice. The IκB-α (P=0.009) was increased after treatment with GAS6 in a dose-dependent manner. Conclusions GAS6 has protective effect on septic lung injury in mice, and its molecular mechanism may be associated with inhibiting inflammatory response and suppressing NF-κB nuclear translocation.
Key words: Gas6     Sepsis     Mice     Acute lung injury     Inflammatory factors     TNF-α     IL-1β     NF-κB     IκB-α    

脓毒症是由严重创伤、大量失血、休克及外科大手术继发感染引起的全身性炎性反应综合征,是危重病房内患者最常见的死亡原因[1]。在脓毒症并发的多器官损伤中,肺脏是最易受损的靶器官,早期即可出现急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(acute lung injury acute respiratory distress syndrome, ALI/ARDS)[2]。脓毒症ALI的发生发展与促炎细胞因子的过度释放以及核因子-κB (nuclear factor-κB,NF-κB) 活化密切相关[3-4]。生长停滞特异性基因6(growth arrest-specific gene 6, Gas6) 蛋白是人类发现的一类新的生长因子,它作为受体酪氨酸激酶家族(RTKs) 中TAM受体的配体,与TAM受体相互作用后具有促吞噬、抗凋亡和调控凝血功能等生物学效应[5]。研究发现Gas6还具有重要抗炎和免疫负调控作用[6],提示Gas6在脓毒症肺损伤治疗中可能极具应用价值。本研究拟建立小鼠脓毒症模型,通过不同剂量的Gas6蛋白干预后,检测血清中TNF-α、IL-1β表达水平,测定肺组织湿/干质量比值(W/D),观察肺组织病理学变化,行HE染色,计算肺病理组织评分,检测小鼠肺组织胞核NF-κB、胞浆IκB-α蛋白的表达水平,探讨Gas6对脓毒症小鼠肺损伤的保护作用及其分子作用机制。

1 材料与方法 1.1 主要试剂

Recombinant Mouse Gas6 (R&D公司,明尼阿波利斯,美国);小鼠TNF-α,IL-1β ELISA试剂盒(西唐生物科技有限公司,上海,中国);兔抗小鼠NF-κB、IκB-α(abcam公司,剑桥,英国);山羊抗兔二抗(abcam公司,剑桥,英国)。天平、电子称、各种规格移液枪、各种规格EP管、4号针头、动物缝合线(伯昊生物科技有限公司,上海,中国);石蜡切片机(leica公司,德国)。

1.2 动物模型制备

雄性BALB/c小鼠,周龄6~8周,体质量18~22 g,由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。脓毒症模型采用盲肠结扎穿孔(CLP) 方法,腹腔注射2%戊巴比妥钠(50 mg/kg体质量) 麻醉后固定,沿前腹中线做一1 cm长的切口,游离肠系膜和盲肠末端,于盲肠游离端至根部约二分之一处结扎,用4号针头在盲端部穿刺一处,挤出稍许肠内容物还纳肠管,缝合关腹。术毕立即皮下注射预热的生理盐水1 mL复苏。假手术组除不结扎和穿刺盲肠外,其余步骤同脓毒症组。

1.3 实验分组及方法

将90只BALB/c小鼠按随机数字表法分为假手术组、脓毒症组、脓毒症+生理盐水组、脓毒症+Gas6干预(1 μg) 组、脓毒症+Gas6干预(5 μg) 组、脓毒症+Gas6干预(10 μg) 组,每组15只。脓毒症组+生理盐水组在造模后尾静脉注射200 μL生理盐水,脓毒症+Gas6(1、5、10 μg) 干预组分别于造模后尾静脉注射用生理盐水稀释的不同浓度的Gas6溶液200 μL。

1.4 造模标准化控制

本实验制作的小鼠CLP模型均符合国内外学者提出脓毒症动物模型标准[7],24 h病死率为47%,满足实验需要。

1.5 肺组织含水量的测定

CLP术后24 h后开胸取左肺吸干表面液体,称湿质量,然后放入80 ℃烤箱烘干至恒质量,称干质量;计算肺组织含水量:肺含水量=(湿质量-干重)/湿质量×100%。

1.6 肺组织病理形态观察及病理学评分

CLP术后24 h后,处死小鼠,即刻手术切取完整右肺叶,4%甲醛固定,常规石蜡包埋,切片,HE染色后行组织学检查并进行肺损伤评分。评分项目包括水肿、充血、中性粒细胞侵润、支气管内出血和碎屑、细胞增生,每项的评分按损伤程度分为0、1、2和3分,取5项评分总和。

1.7 血清TNF-α,IL-1β水平测定

CLP术后24 h,麻醉小鼠,眼球取1 mL全血,静置15 min,1 500 r/min离心10 min,采集血清,-20 ℃保存,用酶联免疫吸附(ELISA) 检测试剂盒测血清TNF-α,IL-1β水平。

1.8 肺组织核蛋白以及胞浆蛋白提取

取右下肺叶组织约100 mg, 用冷PBS充分洗涤, 加入核蛋白提取裂解缓冲液A 1.5 mL, 冰上放置15~30 min, 用电动匀浆器制成匀浆后加入500 μL 10% NP-40, 涡旋10 s, 4℃、12 000 r/min离心30 s, 上清即为细胞浆蛋白。将沉淀物用冷PBS洗涤1次, 4 ℃、12000 r/min离心30s, 弃上清。加入1.5 mL核蛋白提取裂解液B, 冰上放置30 min, 然后4 ℃、12 000 r/min离心2 min, 吸出上清液(核蛋白), Bradford比色法测定核蛋白浓度,置于-70 ℃保存。

1.9 蛋白免疫印迹法检测肺组织胞核NF-κB、胞浆IκB-α蛋白表达水平

制备上样缓冲液,蛋白上样量为50 μg,制备SDS-PAGE分离胶(10%),浓缩胶(4%),在浓缩胶中90 V电泳,当样品进入分离胶时,将电压调至110 V,电泳60 min,转膜,封闭60 min, 加入一抗和内参照抗体,4 ℃孵育过夜;加入山羊抗兔抗体,37 ℃孵育2 h,洗膜后ECL试剂盒显影,用图像分析系统分析蛋白条带灰度值。

1.10 统计学方法

计量资料用均数±标准差(x±s) 表示,应用SPSS 23.0统计软件进行分析处理,计数资料采用χ2检验,计量资料组间比较采用单因素方差分析,两组样本比较采用独立样本t检验。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 一般情况及组织大体形态学检查

脓毒症小鼠术后逐渐出现萎靡、躁动、竖毛、寒颤、腹泻、脓性尿及眼角分泌物增加等表现,精神极差,呼吸急促、呼吸困难,口唇发绀,毛发湿,饮食、水极少,二便量少且大便干燥。濒死前出现寒颤、四肢僵硬、呼吸困难甚至颈项强直。剖腹见腹腔内有混浊脓性渗出液,恶臭;盲肠肿胀变黑,发生坏疽和粘连;空肠肠管胀气;肝、肾充血、水肿,尚有瘀点瘀斑。而Gas6干预组术后上述表现程度减轻, 其中Gas6(10 μg) 组最明显。

2.2 各组小鼠肺W/D

与假手术组相比较,CLP组肺W/D (t=-8.07,P=0.000) 明显升高,差异具有统计学意义。与CLP+Vehicle组相比,Gas6干预组肺W/D值(F=26.43, P=0.000) 下降,差异具有统计学意义。与Gas6 1 μg组相比,Gas6 5 μg组W/D (P=0.012) 下降,差异具有统计学意义;与Gas6 5 μg组相比,Gas6 10 μg组W/D值明显下降(P=0.003),差异具有统计学意义;与Gas6 1 μg组相比,Gas6 10μg组W/D (P=0.000) 下降,差异具有统计学意义(图 1)。

与Sham组相比,aP < 0.01;与CLP+Vehicle组相比,bP < 0.01 图 1 Gas6蛋白对脓毒症小鼠肺组织W/D值的影响 Figure 1 Effects of Gas6 protein on lung W/D in septic mice
2.3 各组小鼠肺组织病理学改变及病理组织评分比较

(1) 电镜观察:假手术组肺脏组织结构完整,肺泡间隔无水肿、炎症,肺泡腔清晰,脓毒症组及脓毒症+生理盐水组小鼠大部分肺泡腔内可见渗出、水肿、出血,肺间质有大量炎性细胞浸润,而Gas6干预各组小鼠上述病变减轻, 其中Gas6 10 μg组最明显(图 2)。

A:假手术组;B:脓毒症组;C:脓毒症+生理盐水组;D:脓毒症+Gas6干预(1 μg) 组;E:脓毒症+Gas6干预(5 μg) 组;F:脓毒症+Gas6干预(10 μg) 组 图 2 各组光镜下肺组织病理学改变(HE×400) Figure 2 Pulmonary histopathologic features (HE×400)

(2) 病理组织评分:与假手术组相比,脓毒症组小鼠肺病理组织评分(t=-16.10,P=0.000) 明显升高,差异具有统计学意义。与脓毒症+生理盐水组比较,Gas6干预组小鼠肺病理组织评分(F=29.44,P=0.000) 下降,差异具有统计学意义。与Gas6 1 μg组相比,Gas6 5 μg组小鼠肺病理组织评分(P=0.019) 下降,差异具有统计学意义;与Gas6 5 μg组相比,Gas6 10 μg组小鼠肺病理组织评分(P=0.001) 下降,差异具有统计学意义。与Gas6 1 μg组相比,Gas6 10 μg组小鼠肺病理组织评分(P=0.000) 明显下降,差异具有统计学意义(图 3)。

与假手术组相比较,aP < 0.01;与CLP+Vehicle组相比,bP < 0. 01 图 3 各组小鼠肺病理组织评分比较 Figure 3 Pathological scores of lung tissues of each group
2.4 各组小鼠血清TNF-α、IL-1β表达水平比较

与假手术组相比,脓毒症组TNF-α浓度明显升高(t=-7.99,P=0.000);差异具有统计学意义。与脓毒症+生理盐水组相比,Gas6干预组TNF-α值(F=27.27,P=0.000) 明显下降,差异具有统计学意义。与Gas6 1 μg组相比,Gas6 5 μg组TNF-α值(P=0.015) 下降,差异具有统计学意义;与Gas6 5 μg组相比,Gas6 10 μg组TNF-α值(P=0.229) 差异无统计学意义;与Gas6 1 μg组相比,Gas6 10 μg组TNF-α值(P=0.0.001) 下降,差异具有统计学意义(图 4)。

与假手术组相比较,aP < 0.01;与CLP+Vehicle组相比,bP < 0. 01 图 4 各组小鼠血清TNF-α的比较 Figure 4 Serum levels of TNF-α in septic mice

与假手术组相比,脓毒症组IL-1β浓度明显升高(t=-9.42,P=0.000) 差异具有统计学意义。与脓毒症+生理盐水组相比,Gas6干预组IL-1β值(F=10.91,P=0.000) 明显下降,差异具有统计学意义。与Gas6 1 μg组相比,Gas6 5 μg组IL-1β值(P=0.404) 差异无统计学意义;与Gas6 5 μg组相比,Gas6 10 μg组IL-1β值(P=0.052) 差异无统计学意义;与Gas6 1 μg组相比,Gas6 10 μg组IL-1β值(P=0.009) 下降,差异具有统计学意义(图 5)。

与假手术组相比较,aP < 0.01;与CLP+Vehicle组相比,bP < 0. 01 图 5 各组小鼠血清IL-1β的比较 Figure 5 Serum levels of IL-1β in septic mice
2.5 NF-κB、IκB-α蛋白表达水平的比较

与假手术组相比,脓毒症组肺组织胞核NF-κB蛋白水平明显升高(t=-12.20,P=0.006),差异具有统计学意义。与脓毒症+生理盐水组相比,Gas6干预组NF-κB值(F=56.49,P=0.000) 明显下降,差异具有统计学意义。与Gas6 1 μg组相比,Gas6 5 μg组NF-κB值(P=0.003) 下降,差异具有统计学意义;与Gas6 5 μg组相比,Gas6 10 μg组NF-κB值(P=0.382) 差异无统计学意义;与Gas6 1 μg组相比,Gas6 10 μg组NF-κB值(P=0.0.001) 下降,差异具有统计学意义(图 6)。

与假手术组相比较,aP < 0.01;与CLP+Vehicle组相比,bP < 0.01 图 6 各组小鼠肺组织NF-κB p65、IκB-α蛋白表达水平的比较 Figure 6 lung expression levels of NF-κB p65 and IκB-α in septic mice

与假手术组相比,脓毒症组肺组织胞浆IκB-α蛋白水平明显下降(t=9.091,P=0.001),差异具有统计学意义。与脓毒症+生理盐水组相比,Gas6干预组IκB-α值(F=7.77,P=0.009) 升高,差异具有统计学意义。与Gas6 1 μg组相比,Gas6 5 μg组IκB-α值(P=0.089) 差异无统计学意义;与Gas6 5 μg组相比,Gas6 10 μg组IκB-α值(P=0.494) 差异无统计学意义;与Gas6 1 μg组相比,Gas6 10 μg组IκB-α值(P=0.029) 升高,差异具有统计学意义(图 6)。

3 讨论

脓毒症是由感染引起的全身性炎症反应综合征(SIRS),严重创伤、烧伤、缺血再灌注损伤及外科大手术后常并发脓毒症[8]。在脓毒症并发的多器官损害中,肺脏是最易受损的靶器官[9]。虽然近年来机械通气手段、液体管理和激素应用等策略不断进步,但脓毒症ALI的病死率仍居高不下,已成为现代医学所面临的突出难题。因此,探索合理的治疗策略是具有重要临床意义的。

广泛、严重的炎症反应可导致细胞外基质的破坏和肺泡膜损伤,是ALI发展的关键环节。在众多参与脓毒症ALI的炎症介质中,TNF-α、IL-1β是最早释放的因子之一[10]。TNF-α可激活多条信号转导通路,引起促炎细胞因子和炎症介质失控性释放[11];还可诱导白细胞迁移、毛细血管内皮细胞活化,致使肺毛细血管渗漏、肺上皮细胞水肿,导致肺通气和换气功能障碍,影响肺功能[12]。IL-1β则主要通过促进巨噬细胞的成熟和分化,上调黏附分子的表达来加强炎性反应[13]。因此,如何有效阻断过度炎症反应一直是脓毒症所致ALI和ARDS治疗学研究的重点方向。

Gas6蛋白是人类发现的一类新的生长因子,属维生素K依赖蛋白,广泛表达于各类细胞,它的天然受体是TAM受体(包括Tyro3、Axl、Mer),Gas6蛋白与TAM受体相互作用后能发挥抗凋亡、促吞噬、抑制炎症等广泛的生物学作用[14;15]。国外有研究显示Gas6可以通过TAM受体抑制TLR信号,发挥抑炎作用[16-17]。本研究发现,与假手术对照组相比,脓毒症组小鼠血清TNF-α、IL-1β水平均明显升高,与报道一致,这表明TNF-α、IL-1β在脓毒症ALI中确实起着重要作用。而与脓毒症组相比,Gas6处理组这两种因子的血清浓度均降低,其中Gas6 (10 μg) 组的TNF-α、IL-1β血清浓度降低最显著,这说明Gas6能够抑制脓毒症所致肺部过度炎症因子释放,从而发挥抑炎作用。

NF-κB是具有多向转录调节作用的序列特异性DNA结合蛋白,能促进多种基因的转录[18]。NF-κB活化可促进单核巨噬细胞和中性粒细胞表达多种促炎性细胞因子,与ALI的关系密切[19]。静息时,未活化的NF-κB以p65/p50的形式与抑制蛋白IκB结合存在于细胞浆内,当受到内毒素、病毒及细菌等刺激时,IκB发生磷酸化继而泛素化降解,与NF-κB解离,NF-κB迅速移位到胞核,与基因上-κB位点特异性结合,促进相关基因的转录,促使机体释放过多炎症介质和细胞因子,造成由炎症细胞和介质构成的炎症反应系统瀑布式级联反应。采取措施调节NF-κB活化,已成为ALI/ARDS分子靶向治疗切入点之一[20]。本研究结果显示,脓毒症组肺组织与正常肺组织相比胞核NF-κB p65含量上升,胞浆IκB-α含量下降,而Gas6处理组与脓毒症组相比,胞核NF-κB p65含量下降,胞浆IκB-α含量上升,其中Gas6(10 μg) 组与正常组基本相同。上述研究结果表明,Gas6能够明显下调胞核内NF-κB p65水平,升高胞浆IκB-α表达水平,提示Gas6对脓毒症小鼠肺损伤保护作用可能是通过下调IκB-α降解、阻断NF-κB向细胞核转位而实现的。

目前,国内外Gas6在脓毒症中的研究越来越多。有研究发现脓毒症患者血清中Gas6水平与脓毒症严重程度和预后密切相关[21]。Gas6在脓毒症急性肾损伤小鼠中可以通过降低血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cre) 值,减少小鼠肾脏组织细胞凋亡,减轻肾脏组织病理学损害来发挥肾脏保护功能[22]。也有研究显示Gas6蛋白可以上调脓毒症小鼠IF水平进一步激活凝血系统,增强凝血功能[23]。本实验研究发现脓毒症组小鼠肺组织W/D值较假手术组明显升高,肺组织病理损伤明显,而Gas6干预组小鼠的肺组织W/D值较脓毒症组有所减低,肺组织病理损伤程度明显减轻,说明Gas6能够有效减轻脓毒症所致的肺损伤。

综上所述,Gas6对脓毒症肺损伤小鼠具有抗炎保护作用且其机制可能与抑制NF-κB通路从而减少炎症因子的表达有关,鉴于笔者前期也发现,外源性Gas6对脓毒症所致急性肾损伤和凝血功能异常也具有保护作用,提示Gas6在脓毒症多器官功能损害中可能极具应用价值。

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