脓毒症常并发于休克、重度创(烧) 伤以及重大外科手术后,是重症患者死亡的重要原因之一[1],病死率高达20%~50%[2]。胃肠道是促进全身炎症反应、严重脓毒症、多器官功能衰竭等疾病的病理生理发展的重要器官[3]。肠道内的内毒素和微生物,在严重创伤、休克、感染、缺血-再灌注等一些病理情况下,有可能经过被破坏的肠黏膜屏障逐步侵入淋巴系统、循环系统以及全身各个脏器和系统,从而导致肠源性脓毒症。脓毒症可致肠黏膜屏障功能障碍、细菌移位、肠道黏膜萎缩和肠通透性增加,肠黏膜上皮细胞的增殖和凋亡, 对维持肠黏膜形态和功能的完整性至关重要。大黄生药对脓毒症患者的胃肠功能衰竭有特殊的功效,然而大黄对肠黏膜屏障保护作用的药理机制尚不清楚。在本研究过程中,首先采取萃取的方法,粗提已有的生大黄,然后使用几种色谱方法,例如反相硅胶柱色谱、ODS C18反相硅胶柱色谱、MCI柱色谱等分离粗提的生大黄。经过以上过程后,总共有21种大黄单体化合物被分离出来,进一步鉴定了这21种大黄单体化合物的分子结构和纯度。通过体外细胞实验证实,得到大黄酸、大黄素、3, 8-二羟-1-甲基蒽醌-2-羧基酸、1-O-咖啡酰基-2-(4-羟基-O-肉桂酰)-β-D-葡萄糖、胡萝卜苷亚油酸酯五种有效单体[4]。本实验通过建立脓毒症大鼠模型, 观察肠黏膜上皮细胞凋亡和增殖,探讨大黄有效成分保护肠黏膜屏障的作用机制。
1 材料与方法 1.1 动物和分组清洁级健康雄性Sprague-Dawley大鼠80只,体质量230~250 g,由第二军医大学实验动物中心提供(动物许可证号:Sc2k沪2015-016)。在本次实验前给予5 d以上时间以适应整个实验环境。脓毒症模型采用盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP) 模型。进行模型制备前12 h,给予实验大鼠禁食,同时不禁水。称质量后,用1%戊巴比妥溶液(30 mg/kg) 进行腹腔麻醉。大鼠取仰卧位,四肢及口腔部固定在实验台上,除去腹部手术部位的毛发。待麻醉药物起作用后,于实验大鼠的下腹部正中切开大约1 cm,逐层分离皮下组织及肌肉层直至进入腹腔,手术操作遵循无菌原则。直视下找到盲肠后,小心分离盲肠系膜,用无齿镊仔细把盲肠肠内容物推向远端,使用手术丝线游离盲肠总长度的大约50%(中度CLP模型),然后结扎。用22号针头在已经结扎的盲肠的游离端进行对穿一次,并挤出少许肠内容物,注意避免粪便污染,并用生理盐水2 mL浸润肠管,假手术组不进行结扎穿孔操作,其余操作同脓毒症组。术毕逐层关腹,消毒手术部位,在实验大鼠的腹壁下层注射生理盐水3 mL,置笼内自由活动。
大鼠随机(随机数字法) 分成单纯对照组(A组),脓毒症组(B组),地塞米松治疗组(C组) 和各大黄单体治疗组,其中包括大黄酸治疗组(D组),大黄素治疗组(E组),3, 8-二羟-1-甲基蒽醌-2-羧基酸治疗组(F组),1-O-咖啡酰基-2-(4-羟基-O-肉桂酰)-β-D-葡萄糖治疗组(G组),胡萝卜苷亚油酸酯治疗组(H组)。地塞米松治疗组:CLP后立即注射地塞米松0.5 mg/kg。各大黄单体治疗组:CLP后立即口服大黄单体。以100 mg/kg灌胃治疗24 h后处死大鼠,生理盐水冲洗肠腔,取回肠末端组织约5 cm经4%多聚甲醛固定。
1.2 指标检测及检测方法常规脱水、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色,在光镜下观察小肠黏膜形态,行增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA) 测定以及行末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL) 检测凋亡细胞。
细胞凋亡(TUNEL) 测定:试剂盒购自瑞士Roche公司, 按说明书操作。切片脱蜡,梯度乙醇水化。微波增透,湿盒(37 ℃) 内经蛋白酶K消化20 min,PBS洗2 min × 3次;加体积分数为0.3%的H2O2甲醇液以阻断内源性过氧化物酶,30 min,PBS洗5min×3次;加入TUNEL反应液,湿盒内(37 ℃) 孵育1 h,PBS洗2min×3次;加30 μL转化物过氧化物酶连接的抗荧光素抗体湿盒内(37 ℃) 孵育30 min,PBS洗2 min×3;3,3′二氨基联苯胺(DAB) 显色,苏木精复染,树胶封片,显微镜下观察。每张切片均在普通光镜下连续观察10个高倍视野计数阳性细胞数,换算为平均每平方毫米的凋亡细胞数,即为凋亡指数(apoptosis index,AI)。
PCNA测定:采用HC-EnVision二歩法, 试剂盒购自美国Santa Cruz Biotechnology公司, 按说明书操作。切片常规脱蜡入水后, 磷酸盐缓冲液(PBS, pH=7.4) 冲洗3次, 每次5 min (下同)。每张切片加50 μL过氧化物阻断溶液, 室温孵育10 min, PBS冲洗3次, 微波抗原修复30 min, 加BSA封闭液, 室温孵育10 min; 加一抗小鼠抗PCNA抗体50 μL, 4 ℃过夜; PBS洗涤3次后, 加50 μL生物素化二抗工作液, 室温作用30 min后, PBS冲洗3次。加链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC) 工作液50 μL, 室温作用30 min后, PBS洗涤3次, 最后DAB显色10 min, 苏木素淡染, 中性树胶封片, Olympus显微镜观察。结果判定, 细胞核着色为PCNA阳性。计算免疫组化图像中阳性区域面积和阳性面积比以及吸光度(Optical Density)。免疫组化阳性指数=阳性面积×OD/总面积。
1.3 统计学方法所有数据均使用SPSS 20.0统计软件进行分析处理。计量资料数据以均数±标准差(x±s) 表示,进行单因素方差分析(one-way ANNOVA),组间比较采用LSD-t检验,方差不齐时采用非参数的秩和检验,以P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 肠黏膜形态学假手术组大鼠肠黏膜各层结构正常存在,肠绒毛完整。脓毒症组大鼠较正常对照组肠黏膜,正常结构消失,肠绒毛脱落, 肠绒毛上皮下间隙水肿明显, 有溃疡伴出血,炎性细胞侵润。地塞米松治疗组黏膜萎缩较脓毒症组明显减轻,部分绒毛有损伤脱落、部分肠绒毛有出血和溃疡,少量炎性细胞侵润。大黄单体治疗组与对照组及地塞米松组比较, 肠绒毛损伤程度较轻, 少量脱落,部分肠绒毛上皮下间隙水肿,部分肠绒毛有出血,少量炎性细胞侵润。见图 1。
2.2 肠黏膜上皮细胞凋亡假手术组凋亡细胞呈表达很强的棕褐色信号。脓毒症组凋亡细胞表达颜色变淡,分布不均,表达逐渐减弱。地塞米松治疗组与大黄单体治疗组claudin-5蛋白信号颜色和表达程度居中。见图 2。
脓毒症组凋亡指数与假手术组比较有明显升高(P < 0.05), 地塞米松治疗组的凋亡指数较脓毒症组明显降低,但仍然高于假手术组(P < 0.05)。各大黄单体治疗组的凋亡指数则显著低于脓毒症组(P < 0.05), 而与地塞米松治疗组差异无统计学意义(P>0.05)。见表 1。
组别 | 例数 | 凋亡指数 |
A组 | 10 | 7.72±1.24b |
B组 | 10 | 24.52±6.27a |
C组 | 10 | 14.58±2.51ab |
D组 | 10 | 13.12±2.10ab |
E组 | 10 | 13.74±3.79ab |
F组 | 10 | 12.31±2.38ab |
G组 | 10 | 14.02±2.33ab |
H组 | 10 | 12.94±2.12ab |
注:与假手术组比较,aP < 0.05;与脓毒症组比较,bP < 0.05;A单纯对照组;B脓毒症组;C地塞米松治疗组;D大黄酸治疗组;E大黄素治疗组;F 3, 8-二羟-1-甲基蒽醌-2-羧基酸治疗组;G 1-O-咖啡酰基-2-(4-羟基-O-肉桂酰)-β-D-葡萄糖治疗组;H胡萝卜苷亚油酸酯治疗组 |
在假手术组大鼠肠黏膜组织中可以发现,PCNA阳性细胞主要分布在肠腺隐窝区。见图 3。脓毒症组大鼠肠黏膜上皮细胞PCNA阳性指数较假手术组显著降低(P < 0.05), 而地塞米松治疗组和各大黄单体治疗组PCNA阳性指数较脓毒症组明显增高(P < 0.05), 但仍低于假手术组(P < 0.05)。见表 2。
组别 | 例数 | PCNA阳性指数 |
A组 | 10 | 175.99±15.86b |
B组 | 10 | 46.40±16.10a |
C组 | 10 | 124.53±9.2ab |
D组 | 10 | 117.18±18.21ab |
E组 | 10 | 120.42±33.12ab |
F组 | 10 | 132.98±21.66ab |
G组 | 10 | 103.61±28.76ab |
H组 | 10 | 112.05±21.48ab |
注:与假手术组比较,aP < 0.05;与脓毒症组比较,bP < 0.05;A单纯对照组;B脓毒症组;C地塞米松治疗组;D大黄酸治疗组;E大黄素治疗组;F 3, 8-二羟-1-甲基蒽醌-2-羧基酸治疗组;G 1-O-咖啡酰基-2-(4-羟基-O-肉桂酰)-β-D-葡萄糖治疗组;H胡萝卜苷亚油酸酯治疗组 |
肠屏障功能障碍在脓毒症的发生发展中起着至关重要的作用。缺血再灌注损伤、营养缺乏和细菌感染等因素均可造成肠黏膜萎缩、破损, 肠黏膜屏障破坏及通透性增高,引起肠道细菌的移位,导致脓毒症的发生和发展[5]。肠黏膜上皮的生长、修复和完整性的维持是黏膜屏障功能的基础,肠黏膜上皮细胞增殖和凋亡的动态平衡,维护着肠黏膜屏障的稳定性,过度的肠黏膜细胞凋亡必然引起肠屏障结构的损伤[6]。明确脓毒症患者肠道屏障功能障碍机制,从源头阻断上述病理过程,是提高重度脓毒症救治成功率的关键。
研究表明, 大黄生药能抑制肠道内细菌和内毒素易位,改善肠黏膜血流灌注[7]。临床研究显示大黄能改善危重病患者胃肠功能,有效缓解中毒性肠麻痹。但大黄生药是个成份非常复杂的复合体,成份多达百种以上。笔者对大黄有效药效部位进行了制备工艺研究,并对得到的提取物化学成分进行较系统研究,通过体外细胞实验证实,得到大黄酸,大黄素,3, 8-二羟-1-甲基蒽醌-2-羧基酸,1-O-咖啡酰基-2-(4-羟基-O-肉桂酰)-β-D-葡萄糖,胡萝卜苷亚油酸酯五种有效单体。然而,大黄对肠黏膜屏障保护作用的药理机制尚不明确,是否通过黏膜上皮细胞凋亡和增殖而实现, 尚不清楚。
细胞凋亡是细胞死亡的活化基因调整机能, 通过此类调整,能够逐步淘汰已经损害、老化和非必要的组织细胞,以保持内环境稳定[8]。对于代谢相当频繁的胃肠上皮来说,细胞凋亡为基础生理程序[9]。在生理过程中, 细胞凋亡通常是处于低水平的,从而能够维护肠道黏膜屏障的正常生理功能[10]。凋亡增加可引起细胞间紧密连接分离,间质裸露,影响肠黏膜上皮的再生与修复,导致黏膜屏障损伤。脓毒症患者胃肠功能失衡被认为与肠上皮细胞受损有关。在鼠注射LPS脓毒症腹膜炎模型中发现肠上皮细胞凋亡明显增加[11]。也有研究发现,LPS脓毒症大鼠模型在肠大部分切除后,肠道适应力受到抑制。凋亡已在理论上被认为在脓毒症的病理生理学机制上发挥了及其重要作用。在人和动物尸检中发现,肠和淋巴细胞上均存在凋亡细胞。有研究发现,抑制肠上皮和淋巴细胞的凋亡可改善脓毒症大鼠的生存率。肿瘤合并脓毒症患者肠内皮细胞凋亡率明显高于正常脓毒症大鼠[12]。这一结果说明脓毒症合并其他疾病能加剧肠道细胞的凋亡,但这仍需研究证明脓毒症大鼠病死率升高同肠上皮细胞凋亡有关。
本研究用TUNEL染色法检测脓毒症时肠黏膜上皮细胞凋亡情况,有很多非对称的断裂点会在细胞凋亡时出现双链DNA上,从而使3’-OH端暴露出来。脱氧核苷酸被生物素或荧光素等标注后,能够被末端转移酶所催化,这个过程完成后,可加入到暴露的3’-OH末端。加入量的多少可用来统计凋亡细胞所占百分比。实验结果显示,各脓毒症组细胞凋亡指数明显增加,显著高于假手术组,同时电镜观察显示假手术组肠黏膜表面绒毛完整。而各脓毒症组大鼠肠黏膜被严重破坏, 肠绒毛有显著的损伤,隐窝结构消失,说明脓毒症大鼠肠上皮凋亡明显增加,使得肠黏膜屏障受到破坏。各大黄单体治疗组和地塞米松治疗组的凋亡指数显著低于脓毒症组,同时电镜观察显示, 肠黏膜损伤程度较轻, 部分绒毛长出,说明大黄单体能改善肠上皮细胞凋亡,维护肠黏膜屏障功能。以上实验结果表明, 大黄单体能够减轻肠黏膜上皮细胞凋亡, 且大黄单体减轻细胞凋亡的作用和减轻上皮形态损伤相一致, 提示大黄单体维护肠黏膜屏障的功能很有可能和肠黏膜细胞凋亡相关。然而大黄单体对肠黏膜上皮细胞凋亡作用的具体机制尚不清楚,需进行更多的实验研究以明确。
增殖细胞核抗原(PCNA) 是一种与细胞周期有关的非组蛋白的核内蛋白,是相对分子质量为36 000的DNA多聚酶σ的辅酶蛋白[13]。PCNA为细胞核DNA合成所必需,出现在所有增殖期的细胞核中,由细胞周期的G1期开始出现, 在S期(DNA合成期) 合成和表达达到高峰, 其含量与细胞增殖状况密切相关[14]。在细胞分裂周期中,可较好判断细胞是否处于增殖状态,是体现细胞增殖的当前状态有效的生物分子学标志[15]
本实验发现,在假手术组大鼠肠黏膜组织中,PCNA表达较强,阳性细胞主要分布在肠黏膜上皮的基底部, 少数分布在腺管中部。PCNA在脓毒症组肠黏膜中的表达量较假手术组明显降低(P < 0.05),表明脓毒症时, 由于肠道黏膜受损, 小肠黏膜缺血萎缩, 肠黏膜上皮细胞增殖减慢,肠黏膜组织PCNA的含量显著下降。而地塞米松治疗组和各大黄单体治疗组PCNA阳性指数较脓毒症组明显增高(P < 0.05), 说明在使用地塞米松和各大黄单体治疗后,肠黏膜上皮细胞增殖显著增加, 肠黏膜萎缩明显改善,表明应用大黄单体可减弱肠黏膜损伤, 促进黏膜细胞的增殖。
综上所述,大黄单体可以遏制脓毒症的发生发展,有可能通过增强肠黏膜细胞的增殖,以及遏制肠黏膜细胞的凋亡,有效的保护了肠道黏膜屏障功能。提示若能在临床中合理利用,或能有效地保护肠道屏障功能,从而有效治疗和预防脓毒症及多器官功能障碍。
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