2017, Vol. 26
血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的增殖和迁移是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)发展过程中重要的病理基础[1-2]，也是造成支架植入或冠脉搭桥术后血管再狭窄的重要原因[3-4]。研究显示VSMCs在不同的分化阶段有不同的细胞表型，不同表型之间的VSMCs生理特性相差巨大，并且在外界因素发生变化时，VSMCs不同表型之间可以相互转化[5]。正常血管中的VSMCs一般是已分化的“收缩型”VSMCs；在血管受到损伤时，一些已分化的“收缩型”VSMCs可以去分化成为“合成型”细胞。“收缩型”VSMCs低增殖，低分泌，特异性表达SMA、calponin、 SM-MHC等具有标志意义的特征性蛋白，“合成型”VSMCs增殖加快，细胞外基质分泌增加[6]，表达“收缩型”细胞所没有的OPN蛋白[7]。 笔者过去的研究结果显示少量饮用低浓度的黄酒可以减少LDLR-/-小鼠主动脉内粥样硬化斑块的面积，低浓度的黄酒还可以抑制VSMCs增殖迁移以及分泌MMP2[8]。笔者研究结果进一步发现黄酒中的多酚类成分可以抑制小鼠主动脉AS的进展[8]，但是黄酒多酚抑制AS的具体机制尚未阐明。本实验通过用不同浓度的多酚干预经同型半胱氨酸(Hcy)诱导之后的VSMCs，分别用雷帕霉素和MHY1485抑制或激活mTOR/P70S6K通路，验证黄酒多酚是否可以抑制Hcy诱导的VSMCs去分化及其可能的信号通路。
1 材料与方法 1.1 实验材料(1) 实验动物：SPF级SD大鼠，雌雄不限，50 d左右，体质量150~180 g(购自浙江省医学科学院实验动物中心)。
(2) 实验试剂：黄酒多酚(上海中药制药技术有限公司，国家中药制药工程技术研究中心)，乙醚、甲醇、75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、甲醇(杭州化学试剂有限公司)，DMEM高糖培养基、PBS、0.25%胰蛋白酶-EDTA、青霉素和链霉素(杭州吉诺公司)；同型半胱氨酸(Sigma公司)胎牛血清(GIBCO公司)，MTT(Emresco公司)；DAPI(Roche 公司)；兔抗大鼠SM-actin 单克隆抗体、兔抗Calponin、SM-MHC、OPN多克隆抗体(ABCOM公司)，兔抗p70s6k、p-p70s6k多克隆抗体(Cell Signaling公司)；辣根过氧化酶标记的山羊抗兔或者抗鼠二抗、FITC、FRITC标记的山羊抗兔IGg(jackson公司)；蛋白免疫印迹以及明胶酶谱相关试剂(江苏碧云天生物技术研究所)。
1.2 实验方法 1.2.1 VSMC原代细胞培养以及鉴定采用组织贴块法培育大鼠胸主动脉VSMCs，采用形态学观察和细胞免疫荧光检测平滑肌肌动蛋白(SMA)鉴定VSMCs，通过SMA与DAPI核染之间的关系鉴定VSMCs的纯度。取第3~5代细胞用于后续实验，实验中细胞加干预因素时用含1.0%胎牛血清的培养基。
1.2.2 MTT法测VSMCs增殖取3~5代培养细胞，0.25%胰蛋白酶消化单层VSMCs，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基配成细胞悬液并计数，以每孔6×103个细胞接种于96孔培养板中。待细胞贴壁后，无血清培养基培养24 h使细胞同步化。各组细胞按上述分组加入对应浓度的干预因子，每组设3个复孔，2个不加细胞的空白对照孔。细胞于37 ℃、5% CO2孵箱培养24 h、48 h和72 h。培养结束，每孔加入MTT液20 μL，37 ℃继续孵育4~6 h，终止培养，小心弃去培养上清液，每孔加入150 μL DMSO，震荡10 min，选择490 nm波长于酶联免疫检测仪测定各孔吸光度并记录。以时间为横轴，吸光值为纵轴绘制VSMCs生长表。
1.2.3 细胞划痕实验(woundhealing)测VSMCs迁移 取3~5代培养细胞，0.25%胰蛋白酶消化单层VSMCs，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基配成细胞悬液并计数，以每孔105个细胞接种于6孔培养板中，每孔体积2 mL。细胞铺满板底后，无血清培养基培养24 h使细胞同步化，加入 1.8 mmol/L 羟基脲作用 12 h抑制细胞增殖，用100 μL黄色枪头垂直于孔板制造细胞划痕，吸去细胞培养液，用PBS冲洗孔板三次，洗去划痕产生的细胞碎片。加入各组相应的干预因子，拍照记录0、12、24、48、72、96 h图片，用Image pro plus6.0分析计算出细胞迁移的面积(划痕面积减去迁移后细胞之间剩余面积)，细胞迁移的面积与最开始的划痕面积之间的比值来表示迁移的多少。
1.2.4 Transwell法测VSMCs迁移取3~5代VSMCs，血清饥饿使细胞同步化，加入 1.8 mmol /L 羟基脲作用 12 h抑制细胞增殖，0.25%胰蛋白酶消化单层VSMCs，用含有各组干预因子的DMEM高糖培养基(无血清)配成细胞悬液并计数(3×104个/mL)。各组24孔板配套的Transwell小室(0.8 μm)上室加入200 μL细胞悬液，下室加入下室加入含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基500 μL，分别培养4、8、12、24、48 h。干预结束后以棉签轻轻擦去上层未穿透膜的VSMCs，取下Transwell半透膜，TBS洗涤3次，3.7%多聚甲醛室温固定5 min，流水冲洗后，用2 μg/mL的DAPI染核，PBS冲洗后，荧光显微镜下随机每组取5个视野计数穿膜细胞数并记录。
1.2.5 细胞免疫荧光法检测各组中SM-actin在细胞中的分布及表达将第3~5代细胞接种于96孔板，每孔3 000~5 000个细胞，待细胞贴壁后加入各组干预因子，在细胞融合之前进行检测。先PBS洗3遍，用4%多聚甲醛固定，0.25%Triton X 100穿破细胞膜，山羊血清室温封闭1 h，加入稀释了250倍的anti-SMA抗体，4 ℃过夜，PBST清洗3遍之后加入结合有FICT或者FRICT的山羊抗兔二抗，室温孵育1 h后PBST清洗3遍，荧光显微镜拍照后图片用Image pro plus 6.0分析。
1.2.6 Westernblot测定VSMCs中SM-actin、calponin、SM-MHC、OPN、P70S6K和p-P70S6K的表达 各个干预因子干预48 h之后，裂解VSMCs提取蛋白，BCA法蛋白定量，SDS-PAGE胶每孔加入20 μL样品，80 V 30 min进行蛋白浓聚，120 V 2 h进行凝胶电泳，并用孔径0.45 μm硝酸纤维素膜250 mA 90 min进行转膜。转膜完毕经常温下TBST洗膜×3、脱脂奶粉封闭2 h后，以1∶ 1 000浓度加入兔抗鼠SM-actin一抗(或抗calponin、SM-MHC、OPN、P70S6K、p-P70S6K、β-actin一抗)，4 ℃孵育过夜，常温下TBST洗膜×3，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗孵育后ECL化学发光法检测目标蛋白和内参。暗室柯达胶片显影，Quantity one软件定量分析。
1.3 统计学方法实验数据以均数±标准差(x±s)表示，多组均数比较用单因素方差分析(One-way ANOVE)和LSD-t法，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 实验结果 2.1 VSMCs原代培养及鉴定用组织贴块法培养大鼠胸主动脉VSMCs[9]，大约8 d左右组织块周围有细胞爬出，两周左右细胞融合可以传代。用SM-actin细胞免疫荧光鉴定VSMCs，DAPI核染之后确定细胞纯度在99%以上(图 1)。
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| 图 1 大鼠主动脉VSMCs细胞免疫荧光鉴定(×400) |
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MTT结果显示在加入各组干预因素后，相比于Control组，Hcy组吸光度值明显升高(P＜0.05) ，说明Hcy可促进VSMCs 的迁移；相比于Hcy组，多酚组吸光度值明显降低(P＜0.05) ，并与黄酒多酚的剂量呈正相关，说明黄酒多酚具有抑制Hcy诱导的VSMCs增殖的作用(图 2A)。
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| A：不同浓度黄酒多酚对VSMCs增殖的影响；B：不同浓度黄酒多酚对VSMCs迁移的影响；C：不同浓度黄酒多酚对VSMCs形态的影响；D：不同浓度黄酒多酚对SM-actin、calponin、SM-MHC、OPN表达的影响；与Control组比较，aP＜0.01; 与Hcy组比较，bP＜0.01；Hcy: 同型半胱氨酸; YWPC: 黄酒多酚 图 2 黄酒多酚抑制血管平滑肌细胞去分化 |
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Transwell和划痕实验结果显示在加入各组干预因素后，相比于Control组，Hcy组VSMCs迁移增加(P＜0.05) ；相比于Hcy组，黄酒多酚组VSMCs迁移减少(P＜0.05) ，并与黄酒多酚的剂量呈正相关(图 2B)。
免疫荧光结果显示各组VSMCs中SM-actin荧光形态不同，Control组中细胞细长，呈典型的血管平滑肌细胞形态，在Hcy干预时，平滑肌细胞变圆变宽，失去原有的细胞形态，多酚可以抑制Hcy诱导的VSMCs形态变化(图 2C)。
各组VSMCs中SM-actin的表达量差异无统计学意义(图 2D)；相比于对照组，Hcy组VSMCs中OPN表达增加(P＜0.01) ，calponin和SM-MCH的表达减少(P＜0.05) (图 2D)；相比于Hcy组，多酚组VSMCs中OPN表达减少，calponin和SM-MHC表达增多(图 2D)。
2.3 黄酒多酚抑制mTOR/P70S6K通路的激活各组VSMCs之间P70S6K的表达没有明显区别。相比于Control组，hcy组VSMCs中p-P70S6K的表达明显升高(P＜0.05) ；相比于Hcy组，黄酒多酚组VSMCs中p-P70S6K的表达减少(P＜0.05) ，并与黄酒多酚的剂量呈正相关(图 3)。
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| 与Control组比较，aP＜0.01; 与Hcy组比较，bP＜0.01；Hcy: 同型半胱氨酸; YWPC: 黄酒多酚 图 3 Western blot 检测各组VSMCs中P70S6K和p-P70S6K的表达 |
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雷帕霉素是mTOR的特异性抑制剂，可以显著抑制p-p70s6k的表达，在加入20 nmol/L 雷帕霉素之后，VSMCs的增殖和迁移明显减弱；黄酒多酚(100 mg/L)+雷帕霉素组与Hcy+雷帕霉素组之间VSMCs的增殖和迁移没有明显区别(图 4)
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| A：黄酒多酚和雷帕霉素对VSMCs增殖的影响；B：黄酒多酚和雷帕霉素对VSMCs迁移的影响：C：黄酒多酚和雷帕霉素对P-P70S6K、P70S6K、SM-actin、SM-MHC、OPN表达的影响；Hcy: 同型半胱氨酸; YWPC: 黄酒多酚；与Hcy组比较，aP＜0.01 图 4 雷帕霉素抑制VSMCs去分化 |
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MHY1485是mTOR的激动剂[10]，可以激活mTOR，增加p-p70s6k的表达，在加入10 μmol/L MHY1485之后，黄酒多酚抑制VSMCs增殖和迁移的作用被逆转，VSMCs的增殖和迁移明显增多；黄酒多酚+ MHY1485组与Hcy+ MHY1485组之间VSMCs的增殖和迁移没有明显区别,见图 5。
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| A：黄酒多酚和MHY-1485对VSMCs增殖的影响；B：黄酒多酚和MHY-1485对VSMCs迁移的影响：C：黄酒多酚和MHY-1485对P-P70S6K、P70S6K、SM-actin、SM-MHC、OPN表达的影响；Hcy: 同型半胱氨酸; YWPC: 黄酒多酚；与黄酒多酚组比较，aP＜0.01 图 5 MHY-1485促进VSMCs去分化 |
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自从1979年发现平滑肌细胞具有不同的细胞表型，目前已经发现一大批特异性比较高的可以当作分化成熟VSMCs标志的蛋白，比如与细胞收缩密切相关的SM-actin、SM-MHC、calponin、SM22α、smoothelin等蛋白以及参与细胞骨架构成的h-caldesmon、telokin、β-vinculin、metavinculin、desmin等蛋白[6]。这些蛋白在分化成熟的VSMCs中高表达，其表达量随着平滑肌细胞的去分化而逐渐减少；相反，最近的研究发现骨桥蛋白(osteopontin，OPN)和糖基质蛋白在去分化的VSMCs中开始表达，并且表达量跟细胞的去分化程度正相关[7]。通过检测SM-actin、SM-MHC、calponin、OPN等蛋白的表达情况是最近几年国内外研究者常用的鉴别VSMCs不同细胞表型的方法。
随着“法国悖论”以及“地中海饮食”等概念的提出，国内外大量的研究都证实规律适量的饮用红酒具有心血管保护作用，并且已经阐明红酒的心血管保护作用主要是由于其中的多酚类成分[11]。红酒多酚主要由儿茶素、花青素、白藜芦醇等组成，通过改善血管功能、调节血脂、调节特异性Micro RNA、抑制VSMCs增殖和迁移等作用而发挥心血管保护作用[12]。绍兴黄酒由糯米发酵而成，也富含儿茶素、没食子酸等多酚类物质，本团队前期的动物试验已经证实黄酒多酚具有抑制高脂饮食小鼠动脉粥样硬化的作用和抑制Hcy诱导的VSMCs高表达MMPs等影响细胞外基质平衡的蛋白[8]。本实验进一步证明黄酒多酚具有抑制Hcy诱导的VSMCs表型转化的作用，这可能是多酚具有抗动脉粥样硬化作用的另一机制。
mTOR是细胞生长、增殖、代谢和衰老的重要调控蛋白，该蛋白的活化可以调节下游P70S6K的磷酸化，促进血管平滑肌细胞的增殖。Martin等[13]发现，收缩型细胞向合成型细胞转变后，细胞体内mTOR/P70S6K1信号通路明显增强。本研究表明黄酒多酚可以抑制mTOR/P70S6K通路，减少p- P70S6K的表达。在本实验中，分别用mTOR的特异性抑制剂雷帕霉素抑制VSMCs中的mTOR/P70S6K通路和mTOR激动剂MHY1485激活mTOR/P70S6K通路，最终实验结果显示黄酒多酚是通过抑制mTOR/P70S6K途径抑制VSMCs的去分化(图 6)。
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| 图 6 YWPC抑制Hcy诱导的VSMCs去分化的作用机制 |
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本研究在笔者原先证实黄酒和黄酒多酚具有抗动脉粥样硬化作用的基础上[14-15]，进一步探索发现黄酒多酚具有抗Hcy诱导的VSMCs分化去的作用，并且证明其作用是通过抑制mTOR/P70S6K通路而实现，这可能是其抗动脉粥样硬化的一个重要机制。本实验也存在一定的局限性，黄酒中的多酚类物质是由不同的单体成分组成的混合物，究竟是其中的何种确切成分在发挥作用并不清楚。
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