中华急诊医学杂志  2017, Vol. 26 Issue (1): 76-81
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葛赟, 黄曼, 颜成敏, 陈芬, 马岳峰. miR-34a调控Notch-1/NF-κB信号通路对脓毒症小鼠脑功能的保护作用[J]. 中华急诊医学杂志, 2017, 26(1): 76-81.
Ge Yun , Huang Man , Yan Chengmin , Chen Fen , Ma Yuefeng . Protective effects of miR-34a on brain function of mice with sepsis by regulating Notch-1/NF-κB signaling pathway[J]. Chin J Emerg Med, 2017, 26(1): 76-81.
miR-34a调控Notch-1/NF-κB信号通路对脓毒症小鼠脑功能的保护作用
葛赟, 黄曼, 颜成敏, 陈芬, 马岳峰     
310052 杭州，浙江大学医学院附属第二医院综合ICU(葛赟、黄曼、陈芬、马岳峰)；310023 杭州，杭州市西溪医院ICU(颜成敏)
收稿日期: 2016-08-14
基金项目: 浙江省自然科学基金(LY14H150003)
*通信作者: 马岳峰， Email：yuefengma@126.com.
摘要: 目的 观察脓毒症小鼠脑组织TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10及其Notch-1、NF-κB mRNA及其蛋白表达的动态变化，通过构建miR-34a过表达慢病毒载体及包装，并进行鞘内注射，研究其调控Notch-1/NF-κB信号通路对脓毒症小鼠脑组织各指标的影响。 方法 将清洁级小鼠54只随机(随机数字法)分为假手术组(sham组，n＝9，仅行腹腔开关术)，模型组(CLP组，n=15，采用盲肠结扎穿孔模型)，阴性对照组 ，干预组 ，各组小鼠均于术后24 h，麻醉后处死，留取脑组织标本。观察小鼠行为学变化，术后24 h进行神经功能评分；用ELISA法分别测定脑组织TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的水平；用实时荧光定量-PCR(real-time fluorogenic quantitative-PCR)法测定脑组织Notch-1、NF-κB mRNA表达；用Western Blot法测定脑组织Notch-1、NF-κB蛋白表达；并观察脑组织病理学改变。 结果 与sham组比较，CLP组在术后24 h点神经功能评分、TNF-α、IL-6水平、NF-κB mRNA及其蛋白表达(P＜0.01)、IL-1β显著升高(P＜0.05)，IL-10水平、Notch-1 mRNA及其蛋白表达显著下降(P＜0.01)，NC组在术后24 h点神经功能评分、TNF-α、IL-1β水平、NF-κB 蛋白表达(P＜0.01)、IL-6水平显著升高(P＜0.05)，IL-10水平、Notch-1 mRNA及其蛋白表达显著下降(P＜0.01)，NF-κB mRNA表达差异无统计学意义(P＞0.05)；与CLP组比较，干预组在术后24 h点TNF-α水平(P＜0.01)、NF-κB mRNA(P＜0.05)及其蛋白表达(P＜0.01)显著下降，神经功能评分、IL-1β、IL-6水平差异无统计学意义(P＞0.05)，IL-10、Notch-1 mRNA(P＜0.05)及其蛋白表达(P＜0.01)显著升高，NC组各指标差异均无统计学意义(P＞0.05)。光镜下见CLP术后24 h脑组织损伤，干预组脑损伤有所减轻。 结论 miR-34a调控Notch-1/NF-κB信号通路对脓毒症小鼠脑功能有一定保护作用。
关键词: miR-34a     Notch-1     NF-κB     慢病毒载体     小鼠    
Protective effects of miR-34a on brain function of mice with sepsis by regulating Notch-1/NF-κB signaling pathway
Ge Yun, Huang Man, Yan Chengmin, Chen Fen, Ma Yuefeng     
Department of General ICU, the Second Affiliated Hospital of Medical College of Zhejiang University, Hangzhou 310052, China(Ge Y, Huang M, Chen F, Ma YF); Department of ICU, XiXi Hospital of Hangzhou, Hangzhou 310023, China(Yan CM)
Ma Yuefeng, Email:yuefengma@126.com
Abstract: Objective To observe the dynamic changes of TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-10，and expressions of Notch-1,NF-κB mRNA and their protein levels in the brain tissue of septic mice and intervention effects of intrathecal injection of lentiviral vector of miR-34a gene for regulating Notch-1/NF-κB signaling pathway. Methods A total of 54 mice of clean grade were divided randomly(random number)into four groups，namely sham group(n=9), in which sham-operated laparotomy was performed；CLP group(n=15)，in which the cecum ligation operation(CLP) was performed；NC group(n=15)，in which intrathecal injection of lentivirus 5 μL(concentration 5×108 TU/mL)，one time per day，for 3 days，then CLP was performed on the seventh day；intervention group(n=15)，in wihch intrathecal injection of miR-34a lentivirus 5 μL(concentration 5×108 TU/mL)，one time per day，for 3 days，then CLP was performed on the seventh day. The mice of four groups were sacrificed 24 h after modeling or operation. The changes of behavior of mice was observed and the neurological scores were assessed 24 h after CLP. The levels of TNF-α，IL-1β，IL-6 and IL-10 in the brain were measured by ELISA method. The mRNA expression and protein levels of Notch-1 and NF-κB in the brain tissue were measured by real-time PCR and Western blot method,respectively. Pathological changes of brain tissue were observed under light microscope. Results The neurological scores，the cerebral TNF-α，IL-6 levels，the mRNA expression and protein level of NF-κB(P＜0.01)，and IL-1β levels(P＜0.05) in CLP group 24 h after modeling were higher than those in sham group. The cerebral IL-10 level and the mRNA expression and protein level of Notch-1(P＜0.01) in CLP group 24 h after modeling were lower than those in sham group. The neurological scores，the cerebral TNF-α and IL- 1β levels，and the protein level of NF-κB(P＜0.01)，and IL-6(P＜0.05)in NC group 24 h after modeling were higher than those in sham group. The cerebral IL-10 level，the mRNA expression and protein level of Notch1 in NC group 24 h after modeling were lower than those in sham group. There were no significant difference in neurological socres, IL-1β and IL-6 levels between intervention group and CLP group(P＞0.05).The IL-10 level (P＜0.05) and the mRNA expression(P＜0.05) and protein level(P＜0.01) of Notch-1 in intervention group 24 h after modeling were lower than those in CLP group.There were no significant difference in biomarkers between NC group and CLP group(P＞0.05).The degree of cerebral damage found under light microscope was also ameliorated in intervention group compared with CLP group 24 h after modeling. Conclusion The effects of miR-34a via regulating Notch-1/NF-κB signaling pathway on brain function exerts cerebral protective effects in septic mice.
Key words: miR-34a     Notch-1     NF-κB     Lentiviral vector     Mice    

脓毒症(sepsis)，是由严重烧伤、外科大手术应激后常见的并发症，在早期可引起脑组织的损伤，导致脑功能障碍称为脓毒症相关性脑病(sepsis-associated encephalopathy，SAE)，病死率高达49%，已成为临床危重病的重要死亡原因之一[1-2]。研究表明，炎症反应是SAE发生发展的中心环节，Notch-1/NF-κB信号通路在脓毒症炎症损伤机制中起着重要的作用[3]。近年来又发现，miR-34a可特异性调控Notch通路，调节免疫反应、炎症反应、肿瘤细胞生长繁殖等病理生理过程。本研究应用盲肠结扎穿孔(CLP)法制作脓毒症小鼠模型，通过miR-34a调控Notch-1/NF-κB信号通路对脓毒症小鼠脑损伤的影响，探讨其在SAE治疗中的机制。

1 材料与方法 1.1 实验动物

清洁级雄性ICR小鼠54只，6~8周龄，体质量20~25 g，由浙江大学医学院附属第二医院实验动物中心提供 。实验前禁食8 h，禁水4 h。

1.2 试剂

miR-34a慢病毒(上海吉凯基因化学技术有限公司)；阴性对照慢病毒(上海吉凯基因化学技术有限公司)；TRIzol试剂(美国pierce公司)；M-MLV(美国Promega公司)；dNTPs(美国Promega公司)；oligo dT(上海生工生物工程有限公司)；Bulge-LoopTM qPCR Primer Set(广州锐博生物科技有限公司)；Rnase Inhibitor(美国Promega公司)；Primer(上海吉凯基因化学技术有限公司)；STBR Master Mixture(日本TAKARA公司)；Trizol Reagent(美国Invitrogen公司)；逆转录试剂盒(美国Fermentas公司)；PCR试剂盒(美国Fermentas公司)；ELISA试剂盒(美国R&D Systems公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天科技研究所)；Notch-1兔多克隆抗体(美国Abcam公司)；NF-κB兔多克隆抗体(美国Abcam公司)；β-actin鼠单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；羊抗兔IgG二抗(美国Santa Cruz公司)。

1.3 主要仪器

AB204-A分析天平(梅特勒-托多利上海仪器公司)；CL31高速冰冻离心机(美国thermo公司)；Nanodrop分光光度计(美国thermo公司)；DENLEY DRAGON Wellscan MKs酶标仪(美国thermo公司)；PYX-DHS数字显示隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；1645050稳压稳流电泳仪(美国BIO-RAD公司)；MX3000p Real time PCR仪器(美国Agilent公司)；GelDoc凝胶成像分析系统(美国BIO-RAD公司)。

1.4 实验动物分组及处理

将小鼠随机(随机数字法)分为假手术组(sham组，n=9) ，模型组(CLP组，n=15) ，阴性对照组(NC组，n=15) ，干预组(n=15) 。术后24 h采用动物神经功能评分表对小鼠进行评分，麻醉后处死，留取脑组织标本。CLP组、NC组和干预组采用盲肠结扎穿孔(CLP)法制作脓毒症小鼠模型，以2%戊巴比妥40 mg/kg腹腔注射麻醉，常规腹部备皮后碘伏消毒，铺无菌纱布洞巾，沿腹中线取长约1 cm的下腹部正中切口，用无菌镊探查到盲肠后，以手术丝线在回盲瓣下方盲肠近端1/4出结扎盲肠(避免结扎回肠及盲肠系膜血管)，用20 G针穿刺被结扎的末端盲肠两次，轻轻挤出少许粪便，保证穿刺孔畅通后将盲肠回纳入腹腔，以4-0丝线逐层缝合切口。术毕，于皮下注射生理盐水5 mL/100 g进行液体复苏。sham组不进行盲肠的结扎和穿孔，其余操作同CLP组。NC组和干预组鞘内注射阴性对照慢病毒和miR-34a慢病毒(滴度为5×108 TU/mL)5 μL/d,共3 d，第7天行CLP术，相应时间点腹腔注射等容量生理盐水。

1.5 行为学观察及其神经功能评分表

分别应用耳廓反射(轻轻触碰小鼠外耳道诱发诱发摇头运动)、角膜反射(用棉签轻触小鼠角膜诱发摇头运动)、缩足反射(用钝针头快速针刺小鼠后爪，观察小鼠从针刺至缩足的时间)、翻正反射(将小鼠背部向下放置，计算其回到正常体位时所需的时间)、逃避反应(快速捏压小鼠尾端1 s。观察小鼠出现逃避的时间)评定小鼠的神经功能，每种方法的结果均为正常(2分)，反射减弱(间隔时间＞10 s但≤30 s，1分)和反射丧失(间隔时间＞30 s，0分)，满分为10分。该评分由不知道分组情况的实验人员进行，以避免主观偏倚。

1.6 ELISA法检测TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平

取各组脑组织，制成10%脑组织匀浆，BCA法测定其蛋白浓度，采用双抗体夹心ABC-ELISA法测定TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10指标，严格按照试剂盒说明书操作。

1.7 实时荧光定量-PCR法检测Notch-1、NF-κB mRNA表达

收集各组脑组织，采用TRIzol法提取组织中的总RNA，按试剂盒说明书反转录为cDNA。各孔设置2个复孔。PCR反应条件：第一步预变性95 ℃10 s，第二步95 ℃变性5 s、55 ℃退火、60 ℃延伸34 s，共40个循环。Notch-1上游引物序列5’ -GAGGCGTGGCAGACTATGC -3’ ，下游引物序列5’ -CTTGTACTCCGTCAGCGTGA -3’；NF-κB上游引物序列5’ -AGGATTTCGTTTCCGTTATGT-3’ ，下游引物序列5’ -CCTGAGGGTAAGACTTCTTGTTC-3’ 。以GAPDH基因为内参，GAPDH基因上游引物序列5’ - TGACTTCAACAGCGACACCCA -3’,下游引物5’ - CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA -3’ 。PCR结束后，确定基线范围(从第3个循环起到指数增长前3个循环，一般取3~15个循环)，分析各孔的Ct阈值(阈值=基线信号的标准偏差×10) 。Ct值反映了模板扩增到一定量拷贝数时(处于指数上升期)所需反应循环数大小。为消除每份样本的浓度不一致与每块板之间条件操作因素的差异所形成的误差，需要对所获得的原始Ct值进行标化。每份样本每个基因的Ct值减去该样本GAPDH的Ct值为ΔCt，再减去校正样本的的Ct值为ΔΔCt。取2-ΔΔCt为计算指标。实验重复3次，以验证结果的可靠性。所有数据采用ABI PRISM 2.0软件进行分析。

1.8 Western Blot法检测Notch-1、NF-κB蛋白表达

按照Pierce细胞核提取试剂盒说明书，提取核蛋白，BCA法检测蛋白浓度。SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳浓缩胶质量分数为10%，分离胶质量分数为8%。先用60 V电泳1 h，当待测样品电泳到浓缩胶与分离胶之间的界面时，再将电压升到90 V，电泳至溴酚蓝跑至玻璃板底面时，即停止电泳，进行转膜。半干电转移20 V转膜20 min，ECL显影。结果用凝胶成像分析系统对Western blot胶片进行扫描，Quantity One分析软件进行分析，以Notch-1、NF-κB蛋白密度值与对照β-actin蛋白密度值的比值表示。

1.9 脑组织病理检查

各组小鼠经深度麻醉后打开胸腔，暴露心脏，将磨钝的穿刺针从心尖部插入左心室，在右心耳处剪一小口放血，先以150 mL生理盐水快速灌注，然后减慢灌注速度直至右心耳处流出清亮的液体，再以溶于0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)的4%多聚甲醛150 mL继续灌注固定1 h。然后 打开小鼠颅骨，取其脑组织，脱水，石蜡包埋，切片，进行HE染色，于光学显微镜下观察脑组织的病理变化。

1.10 统计学方法

实验数据计量资料以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。多组间采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，方差不齐则进行秩和检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 术后24 h内小鼠病死率

术后24 h病死率sham组1只(11.1%)，CLP组7只(46.7%)，NC组8只(53.3%)，干预组7只(46.7%)，CLP组、NC组、干预组比较病死率差异均无统计学意义(P＞0.05) ，三组均显著高于sham组(P＜0.05) 。

2.2 各组小鼠行为学变化及神经功能评分

CLP模型小鼠12 h后开始出现竖毛、蜷缩、少动、精神倦怠、少食、体质量减轻、呼吸急促、腹泻、眼角渗出物等。假手术组未见明显异常表现。24 h处死解剖小鼠腹腔内可见血性渗液，盲肠肿胀、粘连，严重的发生肠坏死，色泽暗红。

与sham组(9.6±0.52) 比较，CLP组(6.1±1.37) 、NC组(5.8±1.39) 在术后24 h点神经功能评分明显下降(P＜0.01) ；与CLP组比较，干预组在术后24 h点(6.5±1.43) 神经功能评分差异无统计学意义(P＞0.05) 。

2.3 各组小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平的变化

由表 1可见，与sham组比较，CLP组在术后24 h点TNF-α、IL-6水平(P＜0.01) 、IL-1β(P＜0.05) 显著升高，IL-10水平显著下降(P＜0.01) ，NC组在术后24 h点TNF-α、IL-1β水平(P＜0.01) 、IL-6水平(P＜0.05) 显著升高，IL-10水平显著下降(P＜0.01) ；与CLP组比较，干预组在术后24 h点TNF-α水平显著下降(P＜0.01) ，IL-1β、IL-6水平差异无统计学意义(P＞0.05) ，IL-10明显下降(P＜0.05) ，NC组各指标差异均无统计学意义(P＞0.05) 。

表 1 小鼠脑组织TNF-α，IL-1β，IL-6和IL-10水平(pg/mL，x±s) Table 1 The levels of TNF-α，IL-1β，IL-6 and IL-10 in the cerebral tissue(pg/mL，x±s)
组别只数TNF-αIL-1βIL-6IL-10
sham组
CLP组
NC组
干预组		 9
15
15
15		 234.29±71.94
395.62±57.96b
404.55±71.45b
261.55±74.81c		 196.95±55.66
328.81±65.55a
338.04±102.69b
265.65±82.21		 43.31±15.04
74.45±18.25b
69.26±10.08a
53.74±20.33		 124.84±35.72
48.63±13.47b
58.52±19.33b
87.32±16.73c
注：与sham组比较，aP＜0.05，bP＜0.01；与CLP组比较，cP＜0.01
表选项
2.4 各组小鼠Notch-1、NF-κB mRNA表达的变化

由表 2可见，与sham组比较，CLP组在术后24 h点Notch-1 mRNA表达显著下降(P＜0.01) ，NF-κB mRNA表达显著升高(P＜0.01) ，NC组在术后24 h点Notch-1mRNA表达显著下降(P＜0.01) ，NF-κB mRNA表达差异无统计学意义(P＞0.05) ；与CLP组比较，干预组在术后24 h点Notch-1 mRNA表达显著升高(P＜0.05) ，NF-κB mRNA表达显著下降(P＜0.05) ，NC组差异均无统计学意义(P＞0.05) 。

表 2 小鼠脑组织Notch-1和NF-κB mRNA表达(x±s) Table 2 The mRNA expression of Notch-1和NF-κB in the cerebral tissue(x±s)
组别只数Notch-1NF-κB
sham组91.212±0.1360.748±0.086
CLP组150.716±0.165a1.268±0.230a
NC组150.868±0.123a1.027±0.265
干预组151.019±0.125b0.859±0.124b
注：与sham组比较，aP＜0.01；与CLP组比较，bP＜0.05
表选项
2.5 各组小鼠Notch-1、NF-κB蛋白表达的变化

由表 3和图 1可见，与sham组比较，CLP组在术后24 h点Notch-1蛋白表达显著下降(P＜0.01) ，NF-κB蛋白表达显著升高(P＜0.01) ，NC组在术后24 h点Notch-1蛋白表达显著下降(P＜0.01) ，NF-κB蛋白表达显著升高(P＜0.01) ；与CLP组比较，干预组在术后24 h点Notch-1蛋白表达显著升高(P＜0.05) ，NF-κB 蛋白表达显著下降(P＜0.05) ，NC组差异均无统计学意义(P＞0.05) 。

表 3 小鼠脑组织Notch-1和NF-κB 蛋白表达(x±s) Table 3 The protein expression of Notch-1 and NF-κB in the cerebral tissue(x±s)
组别只数Notch-1NF-κB
sham组90.837±0.0050.552±0.011
CLP组150.313±0.003a0.930±0.014a
NC组150.408±0.003a0.852±0.012a
干预组150.597±0.08b0.643±0.008b
注：与sham组比较，a P＜0.01；与CLP组比较，bP＜0.01
表选项
图 1 小鼠脑组织蛋白表达 Figure 1 The protein expression in the cerebral tissue
图选项
2.6 各组小鼠脑组织病理学检查

图 2示，在光镜下，sham组小鼠脑组织神经元及其胶质细胞形态、结构清晰，锥体细胞突起明显；CLP组、NC组小鼠脑组织可见部分神经元及其胶质细胞形态、结构改变，细胞间隙增大，血管间隙增大。干预组较CLP组、NC组改变有所减轻。

图 2 各组小鼠脑组织病理学改变(HE×400) Figure 2 Morphological changes of the brain tissue in all groups(HE×400)
图选项
3 讨论

脓毒症相关性脑病(sepsis-associated encephalo pathy，SAE)，是由脓毒症引起的中枢神经系统功能障碍，是重症监护室中最常见的脑病之一，发病率在8%~70%不等，病死率高，是目前研究的热点[1-2]。本研究建立SAE动物模型是关键[3]，建模后小鼠出现竖毛、蜷缩、少动、精神倦怠、少食、呼吸急促等细菌感染症状。术后24 h剖腹时腹腔出现恶臭渗出液，盲肠肿胀、粘连，严重的发生肠坏死，色泽暗红。同时在术后24 h点进行神经功能评分，CLP组、NC组、干预组显著低于sham组。病理学检查亦显示，CLP术后小鼠脑组织可见部分神经元及其胶质细胞形态、结构改变，细胞间隙增大，血管间隙增大，以上均提示SAE建模成功。

SAE的发病机制至今尚未完全阐明，目前公认，炎症反应是SAE发生发展的中心环节，大脑通过迷走神经及位于神经内分泌和自主神经核附近的室周器两条途径检测内脏或全身性炎症，活动信号传递到大脑，炎性和抗炎细胞因子大量释放，引起内皮细胞激活、损伤、神经细胞凋亡，导致血脑屏障破坏，大量神经毒性物质通过血脑屏障，最终引起中枢神经系统症状[4-5]。业已证实，NF-κB广泛存在于神经系统的细胞中，是核内参与炎症因子的关键转录因子，对参与炎症反应放大与延续多种因子的基因表达具有重要的调控作用[6-7]。NF-κB活化后，可通过一系列炎性细胞因子(如TNF-α、IL-1β、IL-6等)的基因表达参与炎症反应的发生发展[8-9]。本研究表明，CLP术后24 h点小鼠脑组织TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB mRNA及其蛋白表达较sham组显著升高，而IL-10水平显著下降。

Notch信号系统是多种器官、系统发育过程的中心环节，包括Notch受体、Notch配体及DNA结合蛋白CSL组成[10]，研究显示，Notch受体刺激可激活NF-κB信号途径，从而调节机体炎症反应。研究显示，Notch活化特异性抑制剂DAPT腹腔注射可明显减少小鼠缺血性脑损伤，Notch-1表达升高，Notch-1活化蛋白(NICD)水平下降，NF-κB活性降低，炎症因子产生减少[11]。而Notch-1基因敲除的小胶质细胞受到脂多糖刺激后，得到的结果与前者一致[12]。笔者前期研究也显示，DAPT能降低SAE大鼠海马组织NICD和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP-1) 表达，抑制神经细胞凋亡，减轻记忆功能的损伤[13]。本研究结果表明，CLP术后24 h点小鼠脑组织Notch-1 mRNA及其蛋白表达较sham组显著下降，而NF-κB mRNA及其蛋白表达显著升高。因此，有效阻断Notch-1/NF-κB信号通路，是抑制过度炎症反应的关键途径。

研究发现，MiroRNA是一类非蛋白编码的小RNA，它们通过结合靶基因mRNA的3’ UTR而抑制基因的表达，表现为一种转录后调控基因表达的全新机制，在发育、免疫应答、炎症反应及肿瘤发生发展等病理生理过程中发挥着重要的调控作用[14-15]。研究发现，miR-34a可特异性调控Notch信号通路，调节炎症反应、免疫反应、肿瘤干细胞生长、繁殖等病理生理过程[16-17]。因此，本研究将携带过表达miR-34a基因的慢病毒对脓毒症小鼠进行鞘内注射，结果显示，与CLP组比较，干预组在术后24 h点TNF-α水平、NF-κB mRNA及其蛋白表达显著下降，IL-10水平、Notch-1 mRNA及其蛋白表达显著升高，神经功能评分、IL-1β、IL-6水平差异无统计学意义，但是IL-1β、IL-6水平的均值均小于CLP组。

综上所述，miR-34a调控Notch-1/NF-κB信号通路对脓毒症小鼠脑功能有一定保护作用，为SAE的发病机制及其临床应用研究提供可靠的依据。

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