脓毒症的发病率进年来持续增加^[1-2]，脓毒症常常进一步发展为多器官功能障碍综合征(MODS)，这些受累器官包括肺、肝、肾、心、凝血系统、免疫系统甚至胰腺^[3-6]等。甲状腺做为体内重要的内分泌器官，在脓毒症时，临床上常常可见其血清甲状腺激素水平异常，此类不正常的甲状腺功能检测结果被认为是甲状腺病态综合征(euthyroid sick syndrome，ESS)^[7-8]。为了明确脓毒症时甲状腺功能异常原因及其病理改变，笔者对脓毒症大鼠甲状腺超微结构和功能改变等进行探讨，现报道如下。

T3、T4、fT3、fT4、TSH放射免疫分析盒由北京北方生物技术研究所提供(批号20121220) ；Caspase-3一抗抗体、AbExcel goat anti-rabbit(HRP)由Abcam公司提供(批号分别为GR51429-5、 GR101082-1) ；BCA蛋白定量试剂盒由碧云天生物技术研究所提(批号P0010) ；考马斯亮蓝G-250由上海沃凯药业有限公司提供(批号71011284) ；中分子量预染蛋白Marker(7带)由Fermentas公司提供(批号SM0671) ；Acrylamide、 Bis-Acrylamide由Amresco公司提供(批号分别为0341、0172) ；Ponceaus由Sigma公司提供(批号P3504) ；超微结构观察采用PHILIPS(EM208型)透射电镜。

清洁级健康雄性SD大鼠32只(福建医科大学实验动物中心提供)，体质量180~220 g，随机(随机数字法)分成4组，分别为对照组(C组)、12 h组(12 h组)、24 h组(24 h组)及36 h组(36 h组)，每组大鼠8只。其中12 h组、24 h组及36 h组合称脓毒症组。脓毒症组大鼠术前禁食24 h，不禁水，腹腔注射水合氯醛(300 mg/kg)麻醉下保留自主呼吸。盲肠结扎穿孔术^[9]：剃除腹部毛发后，碘伏棉球消毒，延腹部正中切开1.5 cm腹壁，暴露盲肠，距末端1 cm处结扎盲肠，然后用0.7 mm内径穿刺针单次贯穿被结扎盲肠中点处，由穿刺孔挤出粪便进入腹腔，后将盲肠送回原位，双层缝合腹壁，皮下注射生理盐水3 mL/100 g补充手术失水及抗休克治疗；C组动物不予任何处理。脓毒症模型成功标准：开腹后见被结扎盲肠发黑、肿胀，明显恶臭，腹腔内大量血性腹水。12 h组、24 h组及36 h组分别在术后12 h、24 h、36 h采取标本。腹腔内注射水合氯醛300 mg/kg麻醉下，分离右颈总动脉，穿刺采血约4 mL，1 000转/min高速离心5 min后得血清约2 mL，分装各1.5 mL及0.5 mL，冻存于-20 ℃冰箱备用，分别用于甲状腺功能指标T3、T4、fT3、fT4、TSH的检测，用放射免疫法检测。

在处死大鼠之前，立刻离断气管，上至声门，下至第4~5节气管软骨环，置于0 ℃冰盐水中，镊子小心分离甲状腺左右侧叶，左侧冻存于-20 ℃冰箱，用于检测Caspase-3蛋白表达情况；右侧一分为二，一半固定于4%多聚甲醛，用于TUNEL检测细胞凋亡指数，操作在2 min内完成。免疫印迹法(Western blotting，WB)测凋亡蛋白Caspase-3表达，TUNEL检测甲状腺组织凋亡指数。操作严格按照各指标说明书进行。

甲状腺电镜标本制备与观察：右侧另一部分甲状腺在1 min内浸于3%戊二醛预固定，1.5%多聚甲醛前固定，1%锇酸-1.5%亚铁氰化钾后固定，酒精-丙酮脱水，环氧树脂618包埋剂包埋后超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅染色，透射电镜观察、摄影。

甲状腺激素值以均数±标准差(x±s)表示，各组大鼠甲状腺激素水平的比较采用单因素方差分析。因凋亡指数及Caspase-3表达灰度值均非正态分布，以中位数(M)及四分位数(P₂₅，P₇₅)表示，多组间比较采用非参数Kruskal-Wallis H检验,如存在统计学差异，两两比较采用Nemenyi检验。统计学处理采用SPSS 19.0统计软件包完成，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

T4水平在12 h、24 h、36 h 三个时点均较C组大鼠明显降低(P＜0.05) ；T3水平在36 h时点较C组明显降低(P＜0.05) ，其余两个时点和C组比较差异无统计学意义；fT3、fT4水平均表现为24 h组及36 h组较C组明显降低(P＜0.05) ，其余差异无统计学意义；脓毒症各组TSH水平均较C组低，但差异无统计学意义，见表 1。

脓毒症三组均高于C组，24 h组升高尤为明显，和C组比较差异有统计学意义(P＜0.05) ，12 h、36 h组与C组比较则差异无统计学意义。

各组大鼠甲状腺组织凋亡细胞被染为棕色颗粒样，24 h组及36 h组可见大量被染色的甲状腺滤泡上皮细胞，其结构也受到严重破坏，滤泡破裂塌陷。随着时间延长，凋亡指数有逐步升高趋势。24 h组及36 h组凋亡指数均显著高于C组，差异有统计学意义(P＜0.05) ，见表 2，图 1，2。

图 1 各组大鼠甲状腺Caspase-3蛋白的表达 Figure 1 The dynamic expression of Caspase-3 among control and sepsis groups

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A图为C组(×400) ，可见1~2个细胞着色；B图为12 h组(×400) ，部分上皮细胞成串着色；C图为24 h组(×400) ；D图为36 h组(×400) ；C、D图可见更多细胞染色，且部分甲状腺滤泡塌陷，正常结构破坏 图 2 大鼠甲状腺组织TUNEL染色切片 Figure 2 TUNEL staining on thyroid gland of control group and sepsis groups

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透视电镜下，C组甲状腺滤泡上皮细胞膜完整，胞质内各细胞器结构清晰可见，分泌颗粒丰富，细胞核仁结构正常，染色均匀，微绒毛排列整齐，部分细胞可见出胞分泌；12 h组大鼠甲状腺组织细胞核结构出现体积缩小，染色不均；24 h组大鼠甲状腺细胞膜完整性破坏，胞质内可见较多空泡，细胞器结构欠清，部分严重者，细胞核固缩、脱落于滤泡腔内；36 h组大鼠甲状腺滤泡结构大片破坏、塌陷，周围甲状腺滤泡上皮细胞被大量空泡取代，细胞结构丧失，见图 3。

A图为C组(× 6 300) ，滤泡上皮细胞结构完整，细胞连接清晰可见，细胞核形态正常，染色均匀，胞质内可见线粒体、粗面内质网、高尔基体及较多深染分泌颗粒，部分伸入甲状腺滤泡腔内的微绒毛正在向外分泌；B图为12 h组(× 6 300) ，滤泡上皮细胞核形态发生改变，其内染色质不均匀分布，但细胞膜结构完整，图中呈长方形，细胞器结构清晰，箭头示细胞正处于分泌状态；C图为24 h组(× 6 300) ，滤泡上皮细胞尚由完整的细胞膜包绕，但细胞核明显缩小，染色加深(箭头所示)，胞质未见完整线粒体、内质网等细胞器结构，取而代之的是大量空泡，微绒毛减少且排列紊乱；D图为36 h组(× 3 150) ，滤泡上皮细胞发生核固缩，染色不均匀加深，细胞结构完整性破坏，无细胞器结构，破碎的细胞质脱落于甲状腺滤泡中，残存的部分细胞质内可见大量空泡 图 3 各组大鼠甲状腺滤泡上皮细胞超微结构 Figure 3 The ultrastructural change in thyroid in control group and sepsis groups

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各种危重病导致甲状腺病态综合征早在1980年就有学者报道，表现为血清中甲状腺相关激素水平变化，而不存在甲状腺本身的病变^[10]，血清甲状腺激素水平改变表现为可逆性的甲状腺激素下降，起初是血清T3水平下降和rT3水平的上升，如果条件继续恶化，血清T4也有可能下降，形成一个典型的低T3、 T4而没有代偿性的高水平的TSH的情况，TSH往往都保持正常^[11-12]。经典的ESS被称为低T3综合征，也有学者发现甲状腺病态综合征还包括低T4综合征、低T3T4综合征等^[12]。本实验检测各组大鼠血清甲状腺激素水平发现，脓毒血症组较C组fT3、fT4及T4均明显低下，而TSH差异无统计学意义,和以往报道的甲状腺病态综合征结果基本一致，表明动物模型脓毒症可以导致甲状腺病态综合征。

Caspase-3在细胞凋亡起始和发展过程中起关键作用，是级联反应最关键的凋亡执行和效应蛋白酶，在凋亡程序中起最后枢纽作用^[13]。在该实验中，各组大鼠甲状腺组织均检测到Caspase-3蛋白的表达，进行灰度值比较后发现脓毒症三组均高于C组，提示脓毒症组大鼠甲状腺细胞凋亡增加。各组大鼠甲状腺组织TUNEL法凋亡指数检测发现，24 h组及36 h组明显高于C组，这一结果和Caspase-3蛋白表达基本一致。可见，脓毒症可使甲状腺组织细胞凋亡增加。通过透射电镜发现，脓毒症组大鼠甲状腺滤泡细胞胞膜完整性破坏，胞质内可见较多空泡，细胞器结构欠清；部分严重者，细胞核固缩、脱落于滤泡腔内，严重者甚至出现细胞结构丧失，甲状腺滤泡结构大片破坏、塌陷。脓毒症大鼠甲状腺细胞凋亡增加，超微结构明显改变，表明脓毒症使大鼠甲状腺细胞出现明显损害。

甲状腺病态综合征发病机制，以往认为是由于一些甲状腺抑制物进入血液循环，使血清T3、T4水平降低，从而有利于机体能量需求和代谢水平减低，使机体处于低代谢率状态，达到节省能量，减少消耗目的。因此，甲状腺病态综合征可能是机体保护性机制作用的结果^[14]。也有学者认为，危重症患者，机体因应激反应分泌各种细胞因子，这些细胞因子通过多种途径作用于下丘脑-垂体-甲状腺轴，使甲状腺激素合成、分泌、代谢及反馈等障碍，从而出现甲状腺病态综合征^[15]。

而根据本研究结果，脓毒症导致的甲状腺病态综合征，其原因可能是甲状腺滤泡细胞损害及凋亡增加所致，不只是机体保护性机制作用的结果。当fT3、fT4及T4减低时，根据反馈机制，血浆TSH水平本应该升高，在本研究中，脓毒症大鼠血浆TSH水平反而降低，和C组比较，虽差异无统计学意义，但脓毒症不同时期三组大鼠血浆TSH均减低，也表明脓毒症时大鼠下丘脑及垂体可能也受到一定程度的损害。由图 3可知，随着脓毒症时间的延长，甲状腺细胞的损害越来越严重。可见，当脓毒症不能得到有效控制时，甲状腺和其他器官一样，随着病情的进展，损害将进一步加重，导致机体代谢进一步混乱，从而使患者的病情进一步恶化，这符合以往学者报道的危重患者血清T3和(或)T4值很低时提示预后差的结论^[16]。

严重脓毒症是ICU常见的危重症疾病。严重脓毒症时，机体因应激反应分泌各种细胞因子和炎性介质，如白细胞介素-6(IL-6) 、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等，这些炎症介质以自分泌、旁分泌等方式单独或联合作用于局部和全身，加之微循环障碍、细菌毒素等的共同作用，使全身多个器官受累，常常引起MODS，而MODS不仅会出现肺、心、肝、循环、胃肠道、胰腺等器官功能障碍，从本实验结果可以看出，甲状腺作为重要的内分泌器官，同样可以受到损害，其损害的机制可能和肺、心、肝、肾等体内其他器官一样，是由于炎性介质、细胞因子、微循环障碍、细菌毒素等作用的结果。因此可以认为，在脓毒症引起的MODS中，甲状腺作为一个器官同样受到损害，从而导致功能异常，出现甲状腺病态综合征。