2017, Vol. 26
心源性猝死是严重威胁人类生命和健康的疾病，尽管随着心肺复苏质量的持续改进，初期自主循环恢复(ROSC)占心脏骤停患者的比例可达到30%～40%，但患者最终生存出院率很低，2012年在美国仅约为8.3%[1-2]。初期ROSC患者发生复苏后心功能不全(post-resuscitation myocardial dysfunction,PRMD)的比例高达45%～60%，表现为复苏后左心室收缩和(或)舒张功能不全的严重病理状态，目前发病机制仍未阐明。PRMD加剧了血流动力学障碍，尤其是脑的循环障碍，成为复苏后患者早期死亡的主要原因之一[3-4]。尽早发现和治疗PRMD是改善预后的重要方法。因此，迫切需要建立一个稳定的PRMD动物模型，以便于探讨PRMD的病理生理机制及后续治疗。由于临床上室颤是心脏骤停最常见的类型，故本实验采用右心室内膜电刺激致颤法建立大鼠PRMD模型，并从心肌酶学、影像学、线粒体功能及组织病理等方面观察复苏后72 h内心脏结构和功能的动态改变。
1 材料与方法 1.1 实验动物及分组 1.1.1 实验动物健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，8~11月龄，体质量450~550 g，均由中山大学大学实验动物中心提供(许可证号：SCXK 2011-0029) 。动物在到达实验室后饲养一周，稳定生理参数。
1.1.2 动物分组完成手术操作后，随机数字法把SD大鼠随机(随机数字法)分为5组，分别是复苏后(post-resuscitation,PR)4 h组、PR 12 h组、PR 24 h组、PR 72 h组(每组n=8) 及假手术(Sham)组(n=3) 。复苏失败或复苏成功未存活至预设时间点者，不计入组。
1.2 方法 1.2.1 动物准备SD大鼠术前晚禁食但不禁水，戊巴比妥钠(美国Sigma-Aldrich公司) 45 mg/kg腹腔内注射麻醉，备皮，仰卧位固定，经口直视插入14号气管鞘管(美国Abbocath-T公司)，外接红外线呼气末二氧化碳监测仪(美国 Instrumentation Laboratories 公司)监测呼气末二氧化碳分压(end-tidal carbon dioxide partial pressure，ETCO2)。左股动脉置入23号PE 50聚乙烯管(美国 Becton-Dickinson 公司)监测主动脉压；右侧股动脉同样方法置入一根热电偶微探头(美国 Columbus Instruments 公司)监测血管内温度；左侧颈外静脉置入23号PE 50聚乙烯管至右心房监测右房压；右颈外静脉置4 F鞘管(美国 Cook Critical Care 公司)至右心房，鞘管前端弯曲的指引钢丝(正极)触及右心室内膜，皮下插入针头(负极)，正负极形成回路，准备诱发室颤。持续记录肢体Ⅱ导联心电图，维持核心温度在(36.8± 0.2) ℃。所有的导管均充满5 U/mL肝素盐水并连接压力传感器，通过数据采集卡(Windaq Acquisition System，美国)实时记录数据并电脑存盘。记录大鼠基础状态，包括心率、动脉血压、右房压、ETCO2和体温。冠状动脉灌注压(coronary perfusion pressure，CPP)定义为主动脉舒张压和右房舒张压之差。
1.2.2 电刺激诱导室颤与心肺复苏以最大递增至3 mA交流电诱导心室颤动，持续刺激3 min以防止大鼠自动复律，撤除电刺激后维持未处理的室颤共8 min。采用心肺复苏机械装置 进行频率为200 次/min的胸外按压和100 次/min的同步机械通气，按压和呼吸联动比例为2∶ 1，吸入氧体积分数为100%，维持 CPP(20±2) mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。持续胸外按压 6 min 后,给予连续最多 3 次 2 J 双相波除颤。如未能自主循环恢复(ROSC)，继续按压 30 s后，再次判断：如仍为室颤，则再次连续最多 3 次相同能量的除颤，直至出现 ROSC。重复 3 个循环，仍未 ROSC 视为复苏失败。ROSC定义为恢复室上性心律，平均动脉血压(mean arterial pressure,MAP)≥60 mmHg，并持续 5 min 以上。
1.2.3 术后监测与取材监测血流动力学至 PR 4 h，动物拔管归笼。各组动物分别于PR 4 h、12 h、24 h和72 h行超声心动图检查后采静脉血标本并分离血清，参照试剂盒，ELISA(多功能酶标仪，美国SpectraMax M5) 检测血清CK-MB、troponin I(南京碧云天生物科技公司)水平；PR 72 h采血后即处死，摘取心脏分离线粒体，行线粒体功能(美国 GENMED SCIENTIFICS公司)检测；同时取左室心肌(约40 g)置于冰生理盐水中，去除残血，用10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，备行HE染色。常规解剖了解总体损伤情况，包括有无存在感染，或继发于导管置入、机械通气以及按压引起的损伤。
1.2.4 心脏超声心动图应用彩色超声多普勒诊断仪(探头频率 16~21 mHz，加拿大VEVO2100) 对各组大鼠收缩及舒张功能进行评估。吸入七氟醚维持安静状态，监测肢体Ⅱ导联心电图。取胸骨旁左室长轴及乳头肌平面的短轴，M型超声测量左室后壁舒张末期厚度(left ventricular posterior wall thickness at end-diastole,LVPWd)、室间隔舒张末期厚度(interventricular septum wall thickness at end-diastole,IVSd)；心尖四腔观单平面面积-长度法测量出射血分数(ejection fraction，EF)；同一心动周期分别测量等容舒张时间(isovolumic relaxation time,IVRT)、等容收缩时间(isovolumetric contraction time,IVCT)及射血时间(ejection time,ET)，计算心肌做功指数(myocardial performance index,MPI)，MPI =(IVRT+ IVCT)/ ET。上述指标为3个不同心动周期，至少3次的重复测量的平均值。
1.2.5 心肌线粒体的分离及呼吸功能的测定心脏摘取后1 h内进行相关检测，标本浴于0~4 ℃冰水中。采用动物组织线粒体分离试剂盒(南京碧云天生物科技公司)分离心肌细胞线粒体，线粒体呼吸控制率(respiratory control rate，RCR)检测试剂盒(美国 GENMED SCIENTIFICS公司)检测心肌细胞线粒体的RCR。心肌组织称质量后放入预冷的Dounce匀浆器，加入线粒体分离介质，匀浆后取上清夜。差速离心法(德国 eppendorf 公司)最终获取沉淀，即为提取的线粒体，分离介质重悬线粒体，置于冰槽保存待检。呼吸功能的检测采用Clark氧电极法(Oxytherm 液相氧电极，英国 Hansatech)[5]。室温下校正后，反应槽内加入2.5 mL介质液，基线平稳后开始记录。加入20 μL线粒体悬液，1 min后加入Ⅲ态底物液，测得氧消耗率为Ⅲ态呼吸(R3) ，2 min后加入Ⅳ态底物液，测得氧消耗率为Ⅳ态呼吸(R4) 。线粒体呼吸控制率(RCR)= R3/R4。
1.3 统计学方法应用 SPSS 20.0 统计软件进行统计学分析。计量数据采用均数±标准差(x±s)表示，均通过正态性检验。参数的多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两两比较用 Bonferronni’ post hoc 检验；非参数的多组间比较采用 Kruskal-Wallis H检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.2 各组基线指标及复苏的结果共用40只大鼠，除Sham组的3只外，37只大鼠进行复苏实验，有35只老鼠入组，复苏未成功5只，ROSC率为86%(32/37) 。各组动物体质量、心率、MAP、RAP、ETCO2和血温的基线值差异无统计学意义(P>0.05，表 1)。各组复苏过程血流动力学及ROSC率的差异无统计学意义(P>0.05，表 2)。各组复苏时间及除颤次数的差异无统计学意义。PR 12 h组、PR 24 h组和PR 72 h组至观察时间点共有6只动物死亡(见表 2)，其中4只死因为心功能不全，2只死因为持续癫痫发作。
| 指标 | Sham组(n=3) | PR 4 h组(n=8) | PR 12 h组(n=8) | PR 24 h组(n=8) | PR 72 h组(n=8) |
| 体质量(g) | 495±20 | 505±15 | 507±24 | 498±25 | 490±23 |
| 心率(次/min) | 370±12 | 379±12 | 369±13 | 368±13 | 375±15 |
| MAP (mmHg) | 136±14 | 145±11 | 138±14 | 135±13 | 140±12 |
| RAP (mmHg) | 1.4±0.3 | 1.5±0.2 | 1.3±0.1 | 1.4±0.2 | 1.6±0.3 |
| ETCO2 (mmHg) | 39±4 | 39±3 | 41± 3 | 42±4 | 40±3 |
| 血温(℃) | 37.0±0.3 | 36.9±0.2 | 37.0±0.2 | 37.1±0.3 | 36.8±0.2 |
| 注：MAP为平均动脉压；RAP为右房压；ETCO2为呼吸末二氧化碳分压 | |||||
| 指标 | PR 4 h组 | PR 12 h组 | PR 24 h组 | PR 72 h组 |
| PC 2 min时ETCO2(mmHg) | 15±1 | 14±3 | 16±3 | 15±2 |
| PC 4 min时ETCO2(mmHg) | 15±2 | 13±2 | 15±2 | 15±3 |
| PC 6 min时ETCO2(mmHg) | 16±3 | 14±2 | 15±4 | 14±3 |
| PC 2 min时CPP(mmHg) | 21±2 | 22±3 | 20±3 | 21±2 |
| PC 4 min时CPP(mmHg) | 22±2 | 21±2 | 22±1 | 22±2 |
| PC 6 min时CPP(mmHg) | 20±3 | 20±2 | 21±3 | 20±3 |
| ROSC率 | 8/9 | 8/10 | 8/9 | 8/9 |
| 存活至观察时间(只) | 8 | 7 | 6 | 5 |
| 注：ETCO2为呼吸末二氧化碳分压；CPP为冠脉灌注压；PC为胸外按压；PR为复苏后；ROSC为自主循环恢复 | ||||
ELISA结果示PR 4 h组与Sham组的CK-MB差异无统计学意义(P>0.05) ；PR 12 h组和PR 24 h组的CK-MB高于Sham组(P＜0.05) ；PR 72 h组的CK-MB下降，但仍高于Sham组(P＜0.05) 。复苏后各时间点的troponin I逐步增加，均高于sham组(均P＜0.05) ，见图 1。
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| 指标采用均数±标准差(x±s)表示；与sham组比较,aP＜0.05；与PR 24 h组比较，bP＜0.05 图 1 血清CK-MB、troponin I动态变化 Figure 1 Dynamic changes of serum CK-MB and troponin I |
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超声心动图结果示各组大鼠EF、MPI、IVSd和LVPWd等基线值的差异无统计学意义(均P>0.05) 。与Sham组比较，PR 4 h大鼠EF显著降低且MPI显著增高(均P＜0.05) ，IVSd和LVPWd差异无统计学意义(均P>0.05) ；PR 12 h和24 h的EF值逐步恢复，但低于Sham组(P＜0.05) ； PR 72 h与Sham组的EF差异无统计学意义(P>0.05) ；ROSC后各个时间点的MPI持续增高至PR 72 h(均P＜0.05) ；PR 24 h和72 h的IVSd和LVPWd均高于Sham组(均P＜0.05) ，见图 2和图 3。
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| A：sham组 (n=3) ；B：PR 4 h组(n=8) ；C：PR 12 h组(n=7) ；D：PR 24 h组(n=6) ；E:PR 72 h组(n=5) 图 2 左心室乳头肌平面短轴M型及二维超声心动图 Figure 2 M mode and two-dimensional images from short-axis of left ventricle at papillary muscle level |
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| 计量资料采用均数±标准差(x±s)表示；与sham组比较,aP＜0.05；PR为复苏后; EF为射血分数; MPI为心肌做功指数; IVSd为室间隔舒张末期厚度; LVPWd为左室后壁舒张末期厚度 图 3 超声心动图测量左心室结构和功能参数动态变化 Figure 3 Structural and functional parameters of left ventricle by echocardiography |
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Sham组心肌细胞排列规则，细胞核完整，闺盘清晰。PR 4 h可见心肌细胞肿胀、部分溶解；PR 12 h心肌细胞肿胀更显著，局部肌溶解，可见横向收缩环；PR 24 h无明显肌细胞溶解、肿胀，可见少量炎症细胞浸润和间质细胞增生；PR 72 h心肌细胞排列较紊乱，间质增生显著(图 4)。
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| A：Sham组(n=3) ；B：PR 4 h组(n=8) ；C：PR 12 h组(n=7) ；D：PR 24 h组(n=6) ；E：PR 72 h组(n=5) ；黑色箭头所指为肌溶解，绿色箭头所指为横向收缩环 图 4 各组大鼠心肌组织的HE染色 Figure 4 Comparison of HE staining of myocardial tissue among the groups |
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与Sham组比较，PR 4 h 心肌细胞线粒体的Ⅲ态呼吸速率及RCR明显下降(均P＜0.05) ；PR 12 h和 24 h呼吸功能逐步恢复，仍低于Sham(均P＜0.05) ；PR 72 hⅢ态呼吸速率及RCR与Sham组比较，组间差异无统计学意义(均P>0.05) 。复苏后各组Ⅳ态呼吸速率与Sham组比较，差异无统计学意义(P>0.05) (表 3，图 5)。
| 指标 | Sham组(n=3) | PR 4 h组(n=8) | PR 12 h组(n=7) | PR 24 h组(n=6) | PR 72 h组(n=5) |
| Ⅳ态[nmol of O/(min·mg mitochondrial protein)] | 32.1±2.3 | 31.8±2.7 | 31±2.6 | 30.8±2.5 | 33.8±3.0 |
| Ⅲ态[nmol of O/(min·mg mitochondrial protein)] | 221.7±6.6 | 89.5±5.2a | 103.2±7.3ab | 179.7±9.0ab | 219.7±8.0 |
| RCR | 6.9±0.4 | 2.8±0.3a | 3.3±0.4ab | 5.6±0.4ab | 6.5±0.5 |
| 注：与sham组比较，aP＜0.05；与PR 4 h组比较，bP＜0.05；PR为复苏后；RCR为呼吸控制率 | |||||
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| A：sham组(n=3) ：B：PR 4 h组 (n=8) ；C：PR 12 h组(n=7) ；D：PR 24 h组(n=6) ；E：PR 72 h组(n=5) ；H-MITO IN，线粒体加入的时间标记；Ⅳ，Ⅳ态呼吸，即ADP耗尽后耗氧速率；Ⅲ，Ⅲ态呼吸，即ADP加入后耗氧速率 图 5 Clark氧电极描记线粒体耗氧率曲线图 Figure 5 Representative traces of oxygen consumption of isolated mitochondria by a Clark oxygen electrode |
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本实验采用右心室内膜电刺激诱导室颤导致大鼠心脏骤停8 min并进行心肺复苏6 min，观察复苏后72 h内心功能的动态改变。心脏彩超结果提示复苏后4 h存在收缩期及舒张期心功能不全，随后心功能逐步改善，复苏后72 h心肌收缩功能已恢复正常，但PR 24 h和PR 72 h表现心肌不同程度增厚并舒张功能障碍为主的心功能不全。心肌酶学、线粒体呼吸功能及组织学的结果与心脏彩超的动态变化一致。这个模型的建立为进一步研究复苏后心功能不全的病理生理机制及相关干预治疗奠定基础。
研究发现，复苏后冠脉灌注压未再下降，这提示心功能不全并非持续性的，亦或表现为“心肌顿抑”。在猪的心肺复苏模型中，复苏后心功能的恢复约需要经历24～48 h[6-7]。心脏彩超发现，院外心脏骤停患者ROSC 8 h心脏指数降至最低，复苏后72 h基本恢复正常[8]。目前较少文献对大鼠复苏后心功能动态观察，本实验的结果与上述研究的趋势基本一致。但也有文献报道，院内或院外心脏骤停患者复苏后心功能不全可持续数周至数月不等[9]，这可能与心肌缺血时间、电除颤的能量和次数、基础疾病及血管活性药物的使用等因素相关。Tang等[10]发现随着缺血时间延长，复苏后4 h内测量dp/dt 40值越低，心功能不全程度越严重。参照笔者前期基础，本实验将缺血时间延长至8 min并保持较高的ROSC率，PRMD发生率稳定，是开展PRMD相关研究较为理想的动物模型。
心肌是体内高度需氧组织，活跃的有氧氧化使心肌细胞富含线粒体，后者约占据细胞总体积25%~35%[11]。心脏骤停造成细胞氧耗/氧供失衡，虽然成功复苏后重新氧合的血液能恢复有氧代谢和器官功能，但同时再灌注损伤激活多种病理机制，使线粒体成为缺血-再灌注损伤中重要的效应器和靶目标[12]。笔者前期体外实验发现，在全心缺血-再灌注过程，心肌线粒体呼吸功能下降、超微结构受损，以及能量生成障碍等是造成PRMD可能原因[13-14]。动物实验也发现，大鼠复苏后细胞色素C及细胞质中caspase 3活性明显增高，且与左室每搏做功指数及生存率呈负相关[5-15]。本实验得出，复苏后心肌线粒体呼吸功能与心功能变化趋势基本一致，这为后续以线粒体为靶目标的PRMD治疗研究提供理论基础。
本实验超声心电图发现，复苏后72 h反映心肌收缩功能EF值已恢复正常，而舒张和收缩功能的综合性评价指标MPI仍高于正常，并伴有心室壁的增厚，这提示复苏后期可能存在左室顺应性下降，舒张功能障碍。笔者前期动物实验发现，复苏过程采用50%氧体积分数与100%氧体积分数比较，前者心肌脂质过氧化指标8-iso-PGF2α和MPI值均降低[16]。这提示氧化应激可能在复苏后心肌顺应性改变或心肌重构的病理生理过程发挥重要作用。由于实验观察时间点至PR 72 h，目前仍无法判断舒张功能障碍持续的时间，及间质增生或胶原沉积是否造成心肌顺应性的持续改变，还需要进一步组织病理学检测证实。
综上所述，大鼠室颤法致心脏骤停后心肺复苏，建立复苏后心功能不全模型具有重复性强、复苏成功率高的特点。与大型动物复苏模型比较，老鼠实验费用相对低廉，此模型能够满足心肺复苏基础及临床前期研究的需要，有较好的推广应用价值。
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