中华急诊医学杂志  2016, Vol. 25 Issue (12): 1301-1304
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刘春枝, 张亚昱, 宋丹, 刘春丽, 新春, 王晶, 王晓磊, 梅花, 张钰恒. 蒙古族新生儿呼吸窘迫综合征患儿肿表面活性物质蛋白-B 1580位点基因多态性频率分布[J]. 中华急诊医学杂志, 2016, 25(12): 1301-1304.
Liu Chunzhi, Zhang Yayu, Song Dan, Liu Chunli, Xin Chun, Wang Jing, Wang Xiaolei, Mei Hua, Zhang Yuheng. The correlation between neonatal respiratory distress syndrome and Surfactant protein B genetic polymorphisms in the Mongol nationality from Inner Mongolia[J]. Chin J Emerg Med, 2016, 25(12): 1301-1304.
蒙古族新生儿呼吸窘迫综合征患儿肿表面活性物质蛋白-B 1580位点基因多态性频率分布
刘春枝, 张亚昱, 宋丹, 刘春丽, 新春, 王晶, 王晓磊, 梅花, 张钰恒     
010050 呼和浩特, 内蒙古医科大学附属医院新生儿科
收稿日期: 2016-06-23
基金项目: 国家自然科学基金项目(81260107);内蒙古自治区自然科学基金项目(2011MS1111)
*通信作者: 梅花，Email：meihuayani@sina.com.
摘要: 目的 研究肺表面活性物质蛋白B (SP-B)1580位点基因多态性与内蒙古地区蒙古族新生儿呼吸窘迫综合征(NRDS)的相关性；了解内蒙古蒙古族新生儿SP-B 1580基因多态性频率分布。 方法 采用PCR-限制性片段长度多态性分析技术对内蒙古地区151例蒙古族NRDS患儿(病例组)及151例蒙古族正常新生儿(对照组)进行SP-B1580位点基因型频率检测，并将内蒙古蒙古族新生儿SP-B 1580位点等位基因频率与武汉汉族新生儿、德国高加索人、美国白种人、日本人比较。 结果 内蒙古地区蒙古族新生儿SP-B 1580位点可检出3种基因型：即TT、CT及CC型。病例组3种基因型频率分别为：19.9%、37.1%和43.0%，T等位基因频率为38.4%，C等位基因频率为61.6%。对照组3种基因型分别为25.2%、39.7%和35.1%，T等位基因频率为47.0%，C等位基因频率为53.0%。关于SP-B 1580位点基因多态性病例组与对照组之间差异无统计学意义(χ2=2.299，P=0.317)。内蒙古蒙古族与德国高加索人、美国白种人比较差异有统计学意义(P < 0.05)；内蒙古蒙古族与武汉汉族、日本人比较差异无统计学意义(P＞0.05)。 结论 内蒙古地区蒙古族新生儿SP-B基因型及等位基因频率与不同性别、出生体质量、胎龄、生产方式等无关。SP-B 1580位点与内蒙古地区蒙古族NRDS无明显相关。不同种族SP-B1580基因多态性分布存在差异。
关键词: 呼吸窘迫综合征     肺表面活性物质     蛋白质B     基因多态性     新生儿    
The correlation between neonatal respiratory distress syndrome and Surfactant protein B genetic polymorphisms in the Mongol nationality from Inner Mongolia
Liu Chunzhi, Zhang Yayu, Song Dan, Liu Chunli, Xin Chun, Wang Jing, Wang Xiaolei, Mei Hua, Zhang Yuheng     
Department of Neonatology, Affiliated Hospital, Inner Mongolia Medical University, Hohhot, 010050, China
*Corresponding author: Mei Hua, Email:meihuayani@sina.com.
Fund program: National Natural Science Foundation of China (81260107); Natural Science Fund Project of Inner Mongolia (2011MS1111)
Abstract: Objective To study the association between the SP-B gene 1580 position polymorphisms and neonatal respiratory distress syndrome (NRDS) in the Mongol nationality from Inner Mongolia. To observe the frequency distribution of polymorphisms of SP-B gene 1580 position in the Mongol nationality newborns from Inner Mongolia. Methods The genotypes of SP-B gene 1580 position were detected by using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism assay and gene sequencing in 323 Mongol nationality newborns including the case group and the control group. The SP-B 1580C/T allele frequencies of the Mongol nationality newborns were compared with those of Han nationality from Wuhan city, German Caucasian, American Caucasian and Japanese. Results In the case group, the frequencies of TT, TC, CC at SP-B gene 1580 position were 19.9%, 37.1% and 43.0%, respectively; the frequency of the T allele was 38.4% and C allele was 61.6%. In the control group, the frequencies of TT, TC, CC at SP-B gene 1580 position were 25.2%, 39.7% and 35.1%, respectively; the frequency of the T allele was 47.0% and C allele was 53.0%. There were no significant differences between the case group and the control group (χ2=2.299, P=0.317). The allele frequencies of SP-B 1580 of the Mongol nationality newborns were significantly different from those of German-Caucasian and American-Caucasian (P < 0.05), but were similar to those of Han nationality from Wuhan city and Japanese (P>0.05). Conclusions SP-B 1580C/T gene polymorphism in the Mongol nationality newborns displays no significant correlation with sex, birth weight or gestational age. There is no obvious correlation between SP-B gene 1580 position polymorphisms, allele frequency and the Mongol nationality NRDS. There is heterogeneity in the frequencies of polymorphisms of SP-B 1580 among different ethnic genes.
Key words: Respiratory distress syndrome     Surfactant protein B     Single nucleotide polymorphisms     Newborn    

新生儿呼吸窘迫综合征(respiratory distress syndrome of newborn，NRDS)是导致新生儿死亡的最主要原因，也是导致儿童慢性肺疾病的主要原因之一。一些肺表面活性物质蛋白(surfactant protein，SP)的基因突变或多态性，尤其是SP-A、SP-B等已成为研究热点，目前研究表明SP-A和SP-B基因突变或多态性是NRDS发生的保护因素或风险因素。而在基因研究中，种族背景被认为是重要的影响因素。本研究选择内蒙古地区蒙古族NRDS患儿，着重研究以下2个方面内容：①内蒙古地区蒙古族NRDS患儿与蒙古族正常新生儿SP-B 1580位点基因多态性的比较；②不同种族间SP-B 1580基因多态性的比较分析。

1 资料与方法 1.1 一般资料

病例组：选取2009年9月至2014年12月于内蒙古医科大学附属医院新生儿科住院的蒙古族NRDS患儿151例。NRDS的诊断依据2010版欧洲新生儿呼吸窘迫综合征防治指南[1]。对照组：选取同时间段内蒙古医科大学附属医院住院或母婴同室的蒙古族无NRDS新生儿151例；纳入标准：①胸部X线片提示无肺部感染和NRDS表现；②血常规和CRP检查提示无感染者。

病例组和对照组均需排除：①严重先天性疾病，如复杂型先天性心脏病、膈疝和脑发育不良等；②遗传代谢性疾病，如苯丙酮尿症、先天性甲状腺功能低下和糖尿病等；③母亲孕后期有明确感染史；④多胎；⑤母亲糖尿病；⑥生后窒息。本研究通过内蒙古医科大学伦理委员会批准及家属知情同意。

1.2 方法 1.2.1 标本采集、临床资料收集及提取DNA

抽取病例组和对照组新生儿静脉血0.5 mL，置于EDTA管中抗凝，-80℃冰箱保存，基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)购置于北京博奥森试剂公司，严格按照试剂盒说明书对样本提取DNA。收集所有新生儿性别、出生体质量及胎龄等相关临床资料。

1.2.2 限制性片段长度多态性(RFLP)分析

北京安美生医药科技有限公司合成SP-B基因的上下游引物，分别是：5’ -TGTGTGTGAGAGTGAGGGTGTAAG-3’和5’ -CTGGTCATCGACTACTTCCA-5’。从样本所提取出的DNA总量中取出1~2 μl作为待扩增的基因。使用TAKARA PCR Amplification Kit (Code No.：DR011)进行PCR实验。SP-B基因片段扩增的PCR反应条件：94 ℃ 10 min，94 ℃ 40 s，56-62 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，72 ℃ 7min，循环38次，72 ℃延伸10 min。PCR扩增的产物总长度约为9 700。使用3%的琼脂糖凝胶电泳检测, 观察PCR产物的效果，确定其作为模板在RFLP分析中的质量。RFLP分析由北京安美生医药科技有限公司协助完成。

1.2.3 不同种族间SP-B 1580基因多态性的比较分析

查阅文献，将文献中武汉汉族、美国白种人、德国高加索人和日本人NRDS SP-B1580位点等位基因频率与内蒙古地区蒙古族的基因频率分别进行对比、分析。

1.3 统计学方法

使用SPSS 17.0统计软件对实验对象的一般情况、实验数据进行统计学相关性分析。实验组与对照组一般情况中的性别、胎龄、出生体质量、是否促肺及出生方式的比较采用χ2检验；有关SP-B 1580位点基因多态性的比较也采用χ2检验。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 一般情况的比较

病例组和对照组的比较见表 1。病例组151例，胎龄29周~41周，出生体质量1.1~3.15 kg。对照组151例，胎龄30周~40周，出生体质量1.01~3.2 kg。两组患儿性别、胎龄、出生体质量、出生方式、是否规律促肺成熟等方面差异均无统计学意义(P＞0.05)。

表 1 病例组及对照组患儿一般情况比较 Table 1 Comparison of general situation in two groups
指标病例组对照组χ2值P值
胎龄(周)
≥371820
34~<373745
<3496861.4350.488
性别
男8178
女70730.1200.730
出生体质量(kg)
≥2.52130
1.5~<2.54846
<1.582751.9430.379
生产方式
剖宫产9485
顺产57661.1110.292
规律促肺
是4860
否103912.0760.150
表选项
2.2 碱基序列图

SP-B1580C/T位点基因多态性碱基序列图，见图 1、图 2。

图 1 SP-B基因1580位点CC基因型 Figure 1 SP-B1580CC
图选项
图 2 SP-B基因1580位点TT基因型 Figure 2 SP-B1580TT
图选项
图 3 SP-B基因1580位点CT基因型 Figure 3 SP-B1580CT
图选项
2.3 两组间SP-B 1580位点基因多态性的比较

病例组和对照组中SP-B 1580位点基因型均可检出3种基因型：即TT、CT及CC型。病例组和对照组中SP-B 1580位点基因型经过遗传学平衡检验，均符合Hardy-Weinbery平衡定律(χ2=0.380 9，0.211 2，按自由度为2，P＞0.05)，说明以上各组人群基因型均符合遗传平衡，具有群体代表性。两组之间关于SP-B 1580位点基因多态性的比较差异无统计学意义，见表 2。

表 2 SP-B1580在病例组和对照组的分布(例，%) Table 2 The distributions of genotype and allele of SP-B1580 in case group and control group (case, %)
组别基因型频率等位基因频率
TTCTCCTC
病例组
(n=151)		30
(19.9)		56
(37.1)		65
(43.0)		58
(38.4)		93
(61.6)
对照组
(n=151)		38
(25.2)		60
(39.7)		53
(35.1)		71
(47.0)		80
(53.0)
χ2值2.2992.287
P值0.3170.130
表选项
2.4 不同种族间NRDS SP-B1580基因多态性的比较

将内蒙古蒙古族与武汉汉族、美国白种人、德国高加索人和日本人NRDS SP-B1580位点等位基因频率分别进行对比，结果发现，内蒙古蒙古族与德国高加索人、美国白种人比较差异有统计学意义；内蒙古蒙古族与日本人、武汉汉族比较差异无统计学意义。见表 3。

表 3 不同种族间NRDSSP-B1580C/T等位基因频率分布比较(%) Table 3 The distributions of in frequencies of polymorphisms of SP-B 1580 different ethnic genes (%)
种族n等位基因T等位基因Cχ2值P值
内蒙古蒙古族15138.461.6
武汉汉族28631.568.50.8830.347
美国白种人[3]30453.846.25.1530.023
德国高加索人15756.443.66.5030.011
日本人[4]20327.073.02.7580.097
注：内蒙古蒙古族及汉族新生儿分别与德国高加索人、美国白种人比较，P < 0.05；与日本人比较，P＞0.05；内蒙古蒙古族与汉族比较，P＞0.05
表选项
3 讨论

SP-B基因位于人类2号染色体的短臂上，长度约9 500，由11个外显子和10个内含子组成，主要功能为降低肺泡表面张力、帮助表面活性物质在肺泡表面的分布并维持其稳定性[2]。SP-B的合成受发育和基因双重调节[3]。研究证实SP-B基因与NRDS、BPD等多种肺疾病相关[4]，且其多态性有种族差异[5]。SP-B1580位点(rs1130866)位于SP-B基因第4外显子上，Lin等[6]发现，SP-B1580基因多态性是NRDS的易感因素；大多数研究表明，SP-B1580基因CC基因型可能导致NRDS发生的风险性更大，Marttila等[7]研究SP-B 1580基因C等位基因是NRDS的易感因素，C等位基因增加双胞胎中先露胎儿患RDS的风险；Yin等[8]也有同样的发现，SP-B 1580C/C基因型与NRDS相关；国内曾凌空、卢维城等[9-10]在研究SP-B基因多态性与NRDS易感性的关系时发现C等位基因型可能参与NRDS的发生发展，携带C等位基因的早产儿患RDS的相对危险度为携带其他基因型的2.26倍；而Lyra等[11]研究证明NRDS患儿SP-B1580位点CC、CT、TT基因型频率没有显著差异。对于SP-B1580位点与NRDS的关系国内外的多项研究结论均不一致。

本研究主要比较内蒙古地区蒙古族NRDS患儿与蒙古族正常新生儿之间的SP-B1580位点基因多态性，结果发现两组无差异，说明SP-B 1580位点基因多态性与蒙古族NRDS无相关性，这可能与样本量小、位点选择、民族差异、地理环境等因素均相关。SP-B 1580位点基因多态性分布在不同种族人群中存在差异。武汉汉族新生儿SP-B 1580等位基因频率与德国高加索人、美国白种人及日本人相比较，结果发现武汉汉族新生儿SP-B 1580等位基因频率与德国高加索人和美国白种人差异具有统计学意义，而与日本人相比差异无统计学意义。笔者曾研究发现SP-B 1580C等位基因可能是内蒙古地区汉族儿童患新生儿呼吸窘迫综合征的易感基因之一[12]。此次笔者将内蒙古蒙古族新生儿SP-B 1580位点等位基因频率与武汉汉族、美国白种人、德国高加索人和日本人相比，结果基本一致，内蒙古蒙古族新生儿SP-B1580位点基因频率不同于德国高加索人、美国白种人，但与日本人、武汉汉族新生儿无差异，由此发现种族背景差异是分析等位基因和基因型频率的重要影响因素。NRDS是基因和环境相互作用的结果，目前我国各民族NRDS基因研究尚不全面，因此有必要进行大样本、多民族、多中心、严密设计的研究支持，以期丰富少数民族基因库数据，并为疾病的个体化预防和治疗提供依据。

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