脓毒症(sepsis)是各种严重创伤、烧伤、休克及大手术的常见严重并发症, 可发展为严重脓毒症(severe sepsis)和脓毒性休克(septic shock),病死率极高[1]。心肌抑制是严重脓毒症的常见并发症,发生率常高达40%,是影响预后的重要因素之一,当脓毒症出现心肌抑制时病死率上升至70%[2]。因此,脓毒症诱导的心肌抑制是脓毒症死亡的主要因素之一。研究认为炎症心肌抑制因子是引起脓毒症心肌抑制的主要原因之一。而连续性血液净化(continuous blood purification,CBP)具有非选择性清除炎症介质以及稳定血流动力学等特点,广泛应用于脓毒症、多器官功能障碍、充血性心衰等疾病[3-6]。目前有关连续性血液净化治疗脓毒症心肌抑制的研究甚少。本研究通过建立脓毒症心肌抑制猪模型,观察连续性血液净化治疗对脓毒症心肌抑制的作用。
1 材料与方法 1.1 动物分组及处理动物模型建立:健康乳猪(泰州泰和生物科技有限公司提供)在实验前禁食8 h,咪达唑仑针(3 mg/kg)肌注行麻醉诱导,待麻醉成功后,给予气管插管,接呼吸机辅助通气(纽邦e360),呼吸模式为SIMV+PSV模式,初始呼吸参数:吸氧浓度为25%,通气频率15次/min,吸呼比1: 2,调整潮气量为6 mL/kg,呼气末正压为2 cmH2O (1 cmH2=0.098 Kpa),调节吸入氧浓度和呼吸频率,维持氧饱和度大于95%,呼气二氧化碳浓度30~40 mmHg。给予枸橼酸芬太尼联合丙泊酚镇静镇痛,开放左侧颈内静脉,右侧股动脉穿刺连接PICCO监护仪(Pulsion, Munich, Germany), 左侧股静脉连接小儿血滤管、B超定位下膀胱穿刺尿液引流,监测心电图(ECG)、血氧饱和度及血流动力学参数,B超定位下膀胱穿刺行尿液引流。实验动物在外科操作后稳定30 min,为动物造模前基础状态,记作“Ba”时间点。后给予内毒素(Escherichia coli 055:B5,生产批号:L2880,Sigma公司,美国)静脉注射[20 μg/(kg·h)], 制备脓毒症心肌抑制模型。造模成功标准:根据PICCO数据提示,在心指数或平均动脉压下降50%,即定义为内毒素诱导脓毒症心肌抑制模型[7]。造模成功后采用随机数字法分为实验组(n=6)和对照组(n=6)。两组动物均给予镇静、镇痛、补液、呼吸机辅助以及肝素抗凝等治疗,实验组予以连续性静脉-静脉血液滤过(CVVH)治疗(金宝血滤机,M60膜),两组ACT均维持在180~250 s之间。血液滤过参数为:血流速度50 mL/h; 置换液速度300 mL/h; 超滤20 mL/h。造模成功后而在CVVH治疗之前记为“0”时间点,后连续动态观察CVVH治疗2、4、6 h后下述指标的变化。
1.2 观察指标 1.2.1 血乳酸(Lac)和氧合指数(PaO2/FiO2)用预先已经肝素化的5 mL采血注射器,从股动脉导管抽取约2 mL动脉血,橡皮塞密封隔绝空气,行血气分析(雅培i-STAT 300),记录血乳酸,同时根据氧分压和吸入氧浓度,计算氧合指数。
1.2.2 血流动力学根据PICCO监测仪,记录心率和平均血压变化。PICCO标定采用10 mL的4 ℃水,10 s内进行颈内静脉注射,根据热释波形,计算出心脏指数(cardiac index,CI)、肺毛细血管通透指数(pulmonary vascular permeability index,PVPI)以及血管外肺水指数(extravascular lung water index,EVLWI)。
1.2.3 每小时尿量在2、4、6 h点,监测记录尿量,并根据体质量计算[mL/(kg·h)]。
1.2.4 血清TNF-α、IL-6、IL-10的测定在(Ba,0,2,4,6 h)时间点,分别抽取4 mL血,在4℃下离心后,取上清液分装,后-80 ℃保存待检。采用酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒(Hermes Criterion Biotechnology公司,加拿大)进行检测,严格按照试剂盒说明书步骤进行操作,通过酶标仪测出标准品和样品吸光度(OD值),描绘出标准曲线图和对应回归方程,计算出各样品的相应浓度。
1.2.5 病理学检测实验猪在治疗6 h后,用10%氯化钾处死,分离出心脏组织,经10%甲醛溶液固定、脱水以及石蜡包埋切片,采用苏木精-伊红(HE)染色,在光学显微镜下观察病理改变。
1.3 统计学方法数据以均数±标准差(x±s)表示,计量资料采用成组t检验,计数资料采用χ2检验,应用SPSS 16软件进行统计学分析,以P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 血乳酸(Lac)和氧合指数(PaO2/FiO2)与造模前相比(Ba),造模成功后(0时),两组动物的血乳酸显著性升高,而氧合指数明显下降,但是两组间比较,差异无统计学意义。在治疗6 h后,与对照组比较,实验组的血乳酸和氧合指数均好于对照组(P < 0.05)见表 1。
指标 | 分组 | Ba | 0 h | 2 h | 4 h | 6 h |
血乳酸(mmol/L) | 对照组 | 0.5±0.0 | 4.1±0.8 | 3.3±2.0 | 3.0±1.5 | 2.6±0.3 |
实验组 | 0.2±0.0 | 4.5±0.5 | 3.1±1.8 | 2.6±1.8 | 1.3±0.2a | |
氧合指数(PaO2/FiO2) | 对照组 | 407±55 | 248±45 | 237±43 | 220±55 | 197±51 |
实验组 | 399±67 | 239±58 | 245±58 | 256±48 | 299±61a | |
注:与对照组相应时间点比较,aP<0.05 |
输注内毒素注射后,两组均表现为心率增快、平均动脉压下降、心指数下降、肺毛细血管通透指数升高以及血管外肺水指数增加,但两组间在Ba和0 h,上述指标差异无统计学意义。与对照组相比,CVVH治疗后显著改善上述血流动力学参数,见表 2。
指标 | 分组 | Ba | 0 h | 2 h | 4 h | 6 h |
HR | 对照组 | 137.3±7.5 | 165.1±9.1 | 164.3±7.1 | 165.5±10.3 | 168.9±8.7 |
实验组 | 135.7±7.4 | 163.6±5.9 | 169.1±10.1 | 153.2±7.5* | 132.8±6.4* | |
MABP | 对照组 | 121.3±8.2 | 72.3±8.7 | 72.7±11.1 | 75.8±10.9 | 80.6±8.8 |
实验组 | 122.8±7.6 | 69.4±8.2 | 75.6±8.3 | 88.8±11.1* | 92.7±10.3* | |
CI | 对照组 | 8.1±2.1 | 6.9±1.8 | 5.5±2.3 | 4.9±1.7 | 4.4±2.5 |
实验组 | 8.5±1.3 | 6.5±1.1 | 5.5±3.5 | 5.1±2.3 | 4.94±1.4* | |
PVPI | 对照组 | 1.1±0.3 | 2.8±1.3 | 2.6±0.6 | 2.7±0.4 | 2.9±0.5 |
实验组 | 1.2±0.2 | 2.7±0.3 | 2.4±0.3 | 2.5±0.7 | 2.6±0.5 | |
EVLWI | 对照组 | 15.3±3.9 | 30.5±1.9 | 37.5±1.4 | 38.8±1.2 | 39.5±1.2 |
实验组 | 16.6±3.1 | 34.9±1.3 | 35.5±1.4 | 28.5±1.5* | 20.6±1.8* | |
注:HR(心率);MABP(平均动脉血压);CI(心指数);PVPI(肺毛细血管通透指数);EVLWI(血管外肺水指数);a与对照组比较,P<0.05 |
造模成功后,两组动物每小时尿量均出现减少,但两组(2、4 h)比较差异无统计学意义,在(6 h)每小时尿量实验组多于对照组,差异具有统计学意义(P < 0.05),见图 1。
2.4 血清炎症因子变化输注内毒素注射后(0 h),无论是实验组还是对照组,血清炎症因子TNF-α、IL-6和IL-10均显著增高,差异有统计学意义。与常规治疗组相比,CVVH治疗2、4 h后,对上述因子无明显影响;但在6 h,显著降低血清TNF-α和IL-10的水平,差异有统计学意义(P﹤0.05);而CVVH治疗4 h后,即显著降低血清IL-6水平,并一直延续到治疗后6 h (本实验观察最后时间点),差异有统计学意义(P﹤0.05)。(见表 3)
指标(pg/mL) | 分组 | Ba | 0 h | 2 h | 4 h | 6 h |
TNF-α | 对照组 | 30.7±8.1 | 93.3±9.7 | 90.5±6.6 | 89.5±8.6 | 80.1±4.6 |
实验组 | 32.5±7.7 | 99.7±8.9 | 88.3±4.9 | 80.3±9.9 | 56.3±9.4a | |
IL-6 | 对照组 | 55.7±4.9 | 105.7±9.9 | 95.7±8.9 | 97.7±6.9 | 85.7±6.4 |
实验组 | 57.1±3.3 | 107.1±9.3 | 89.9±8.5 | 67.1±8.3a | 52.1±7.3a | |
IL-10 | 对照组 | 15.7±5.4 | 35.7±8.9 | 30.7±4.9 | 26.7±5.4 | 25.7±4.4 |
实验组 | 17.1±3.9 | 37.1±9.9 | 25.7±6.5 | 24.7±6.9 | 13.7±5.1a | |
注:与对照组比较,aP < 0.05 |
病理显示实验组乳猪心脏组织结构基本正常,无明显炎症细胞浸润;相反,对照组病理可见心肌肿胀、间质散在炎症细胞浸润,见图 2。
3 讨论脓毒症是由严重感染或损伤引发的失控性爆发炎症反应,脓毒性休克是重症监护病房(ICU)患者的主要死因[8-9]。约50%的严重脓毒症患者会出现不同程度的心肌抑制,病死率高达70%~90%[10]。这种脓毒性心肌抑制,由Parker等[11]最早发现,他们发现在感染休克患者中存在心肌抑制,但是经过积极治疗后,这种心肌抑制可以逆转。脓毒症心肌病的主要机制,目前认为是炎症因子造成心肌功能和结构的损伤以及心肌细胞线粒体功能障碍。脓毒症性心肌病存在左心室扩大、射血分数下降以及心功能的可逆性恢复(一般在7~10 d痊愈)这三大特点[12]。本研究发现,脓毒症休克猪模型存在血压下降、乳酸升高以及心脏指数下降,且发现在内毒素注射2 h左右,平均动脉或心输出量下降约30%,这与既往研究报道结果相一致[7]。所以本研究将脓毒症心肌抑制模型定义为在内毒素注射约2 h后,平均动脉或心输出量下降30%;而血液净化治疗能够显著降低血炎症因子水平,同时显著改善心功能。
经过血液净化治疗后,本研究发现血液净化治疗能够降低血清炎症因子TNF-α、IL-6和IL-10浓度,这与既往的研究报道结果相似[13-14],提示连续血液净化治疗可以非选择性的清除炎症介质,减轻全身炎症反应。同时,本实验发现实验组猪心脏指数(CI)升高明显,平均动脉压升高,尿量增多,血乳酸下降明显,说明连续性血液净化可以提高心功能,进而改善血流动力学。这种连续血液净化治疗对心功能的改善与其对心肌直接保护作用相关,通过病理学检查,笔者发现连续性血液净化治疗明显改善脓毒症引起的心肌肿胀和炎症细胞的心脏浸润(图 2)。
目前认为脓毒性休克引起的心功能不全的病因有以下几种:机械性原因、代谢性原因、炎症性原因。由于这些原因,炎症性毛细血管渗漏引起的心肌水肿,造成心肌顺应性、收缩性和整体功能下降[15]。但是脓毒症时炎症反应是引起心肌损伤是最重要的因素[16]。炎症因子被看作是“心肌抑制因子”,其中最重要的心肌抑制因子包括TNF-α和IL-6等[17-19]。TNF-α是脓毒症早期的主要炎症因子,与心肌收缩和舒张障碍有关[20]。TNF-α致诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)产生,NO浓度增高,导致心肌抑制。也有研究表明内毒素及炎症因子对L-型钙离子通道钙内流,使心肌内钙浓度下降和收缩力的下降[15, 21-23]。
连续性血液净化可以通过弥散、对流和吸附非选择性清除各大中小分子炎症介质,本研究发现血液净化治疗,明显降低TNF-α、IL-6和IL-10炎症因子水平,显著改善血流动力学,同时减少心肌肿胀和间质炎症细胞浸润。研究提示连续性血液净化治疗通过清除细胞炎症介质(如TNF-α和IL-6),降低炎症反应水平, 进而减轻炎症介质对心血管功能的抑制,从而达到心肌的保护作用;也可清除抗炎症介质,如IL-10,经过血液净化治疗后,不会因为减轻了机体的SIRS反应,而引发CARS反应,使脓毒症猪血清中炎症/抗炎症介质平衡,达到免疫治疗作用[24];当然,连续性血液净化治疗可能还通过对一氧化氮、心钠素以及儿茶酚胺的影响,进而调节血管和心脏的收缩舒张功能;除此之外,连续性血液净化治疗能够改善氧合(表 1), 而氧合的改善促进心血管系统的代谢,这也可能与间接改善脓毒性心肌功能相关。本实验研究表明,连续性血液净化可以通过清除血炎症因子,减轻心脏组织的炎症损伤,从而改善脓毒性心肌病的心功能和血流动力学,有望成为治疗脓毒性心肌病的一种重要手段。
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