2016, Vol. 25
急件肺损伤(ALI)特征性病理生理改变是各种致病因素引起的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞屏障通透性损伤，进而导致弥漫性肺间质及肺泡水肿，临床以顽固性低氧血症为特征。肾素-血管紧张素系统(rennin angiotensin system, RAS)是一个复杂的瀑布体系和自身调节网络，血管紧张素转化酶2(ACE2)是其重要成员，报道显示，ACE2对脂多糖(LPS)致ALI大鼠肺组织的损伤具有保护作用[1-4]。维生素D (Vit D)是一种脂溶性维生素，主要通过维生素受体(VDR)发挥生理学作用。有研究显示VitD可通过VDR抑制肾素基因的表达，从而对整个RAS系统具有抑制作用[5-6]。但目前尚未见Vit D和ACE2相互作用对ALI/ARDS产生影响的研究报道，本研究在既往工作基础上，进一步探讨Vit D与ACE2相互作用在ALI/ARDS发病机制的影响，为ALI/ARDS的诊治提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料和试剂健康雄性Wistar大鼠，SPF级，体质量(200±20) g：(上海斯莱克实验动物有限公司，合格证编号：2013001806183)；LPS、Triton X-100：(美国Sigma产品)；骨化三醇(上海汉尊生物技术科技有限公司)；凯基全蛋白提取试剂盒(凯基生物科技发展有限公司，中国)；ACE2兔单克隆抗体(Abcam, Cambridge, MA, USA)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG (北京中杉金桥产品)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG (北京中杉金桥产品)；大鼠抗GAPDH单克隆抗体(武汉博士德产品)；蛋白Marker (美国Fermentas产品)；ECL底物发光试剂盒(美国Pierce产品)；化学发光成像系统(上海欧翔科学仪器有限公司，中国)；Trizol (美国Invitrogen产品)；DEPC、RT-PCR试剂盒(美国Promega产品)；Taq酶及buffer、DNA DL2000marker (日本TaKaRa产品)；AceQ qPCR SYBR ® Green Master Mix (南京诺唯赞生物科技有限公司产品)；LightCycler® 480(罗氏医学仪器公司)。
1.2 动物模型制备与分组尾静脉注射LPS复制大鼠ALI模型参考并改良了文献[7-8]的实验方法。将健康雄性Wistar大鼠SPF级，体质量(200±20) g，30只大鼠随机(随机数字法)分为6组，NC组尾静脉注射生理盐水，LPS组尾静脉注射LPS 5 mg/kg，Vit D组给予大鼠每天骨化三醇25 μg/kg连续灌胃3 d，(LPS+Vit D)1~3组分别给予大鼠每天骨化三醇(1 μg/kg, 5 μg/kg, 25 μg/kg)灌胃，于第3天灌胃后给予尾静脉注射LPS 5 mg/kg，所有大鼠于尾静脉注射24 h后进行后续实验。
1.3 观察指标及检测方法①一般情况：分别观察各组大鼠呼吸状况、精神状态、活动情况等变化。②肺组织干/湿质量比：取右肺中叶滤纸吸取肺表面水分和血液后称质量，80℃烘箱内烘干48 h至恒质量，再称质量，计算肺组织干/湿质量比。③肺组织病理：取右肺上叶组织浸入10%甲醛溶液固定48 h后做病理切片，HE染色后观察。
1.4 Q-PCR法检测VDR、ACE2 mRNA 1.4.1 组织总RNA的提取及互补DNA (complementary deoxyribonucleic acid, cDNA)的合成取大鼠肺组织100 mg置于匀浆器中，加入1 ml TRIZOL试剂，按试剂说明书提取组织总RNA。取总RNA 6 μL按逆转录试剂盒步骤逆转录20 μL体系，逆转录的cDNA于-80℃保存。
1.4.2 引物的设计及PCR的扩增根据VDR、ACE2及内参(GAPDH) mRNA的序列设计的引物序列。GAPDH上下游引物序列为5’ -GTGCTGAGTATGTCGTGGAG-3’，5’ -CGGAGATG ATGACCCTTTT-3’；VDR上下游引物序列为5’ -CACAGGCTTCCACTTCAATGCTA-3’，5’ -TCATGCC GATGTCCACAC-3’；ACE2上下游引物序列为5’ -ACCCTTCTTACATCAGCCCTACTG-3’，5’ -TGTCCA AAACCTACCCCACATAT-3’。Q-PCR检测采用SYBR-Green染料法，以大鼠的GAPDH作为内参。将AceQ qPCR SYBR®Green Master Mix试剂取出后上下颠倒混匀，点动离心后置于冰上备用；取出-80 ℃保存的基因引物和cDNA模板解冻后颠倒混匀后点动离心，后续按试剂操作说明书在LightCycler ® 480仪器上设置反应程序，扩增40个循环。
1.5 Westen blot法检测肺组织中VDR、ACE2蛋白 1.5.1 组织总蛋白的提取取大鼠肺组织100 mg置于1.5 mL EP管中用眼科剪将组织剪成3 mm×3 mm小块，加入0.5 mL细胞裂解酶+蛋白酶抑制剂(PMSF)5 μL后转入匀浆器中充分匀浆，按蛋白提取试剂盒进行后续操作。提取的蛋白上清置于-80℃保存。
1.5.2 SDS-PAGE胶电泳ACE2的相对分子质量为90 000，VDR为51 000，故选择8%的分离胶和3%的浓缩胶进行PAGE胶电泳。首先将提取的蛋白上清等体积加入1×蛋白上样缓冲液，置100 ℃水浴锅10 min使蛋白质变性，每孔上样15 μL，并取蛋白marker 5 μL调电压55 V开始电泳，待上样蛋白跑至分离胶后调电压为120 V直至电泳结束。
1.5.3 Westen blot将SDS-PAGE胶中的蛋白转膜至硝酸纤维素膜(NC膜)上。将NC膜置于含5%的脱脂奶粉PBS-T溶液中，摇床慢摇，室温封闭2 h。根据预染marker将NC膜上含VDR、ACE2、内参的部分依次剪下放入用一抗稀释液稀释的一抗溶液中4℃过夜(VDR和ACE2稀释倍数为1: 4 000，内参为1: 2 000)，PBS-T溶液洗膜10 min×3次，随后置于封闭液稀释的二抗中室温孵育45 min，PBS-T溶液洗膜10 min×3次，最后放于化学发光成像分析系统中曝光，注意选择曝光时间及普通ECL发光液和超敏ECL发光液的比例，保存结果用凝胶分析软件分析灰度值。
1.6 统计学方法计量资料以均数±标准差(x±s)表示, 应用SPSS 21.0统计软件分析, 多组均数之间比较采用方差分析，多组间两两比较采用SNK-q法, 以P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 动物一般情况NC组和Vit D组大鼠正常进食饮水、呼吸平稳、皮毛有光泽；LPS组进食饮水明显减少、嗜睡、呼吸急促、寒战等；(LPS+Vit D)1~3组各组大鼠一般情况介于Vit D组和LPS组之间。
2.2 肺组织干/湿质量比与LPS组比较，(LPS+Vit D)1~3组各组大鼠肺干/湿质量比显著减少(P < 0.05)；与Vit D组比较，(LPS+Vit D)1~3组各组肺组织干/湿质量比显著增加(P < 0.05)。见表 1。
| 组别 | 肺组织干/湿质量比 |
| NC组 | 2.32±0.12c |
| LPS组(5 mg/kg) | 7.54±0.20ab |
| Vit D组(25 μg/kg) | 2.47±0.29c |
| (LPS+Vit D) 1组(1 μg/kg) | 5.86±0.26abc |
| (LPS+Vit D) 2组(5 μg/kg) | 5.80±0.23abc |
| (LPS+Vit D) 3组(25 μg/kg) | 5.53±0.35abc |
| 注：与NC组比较，aP < 0.05，与Vit D组比较，bP < 0.05，与LPS组比较，cP < 0.05；(LPS+Vit D)1~3组组间相比，P=0.110。 | |
NC组和Vit D组大鼠肺泡结构完整，LPS组肺组织水肿明显、肺泡间隔增厚、肺泡破裂融合、肺泡内有大量炎症细胞浸润，(LPS+Vit D)组肺组织水肿及炎症细胞浸润情况介于Vit D组与LPS组之间(图 1)。
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| A:NC组；B：LPS组；C：Vit D组；D：(LPS+Vit D)1组(1 μg/kg)；E：(LPS+Vit D)2组(5 μg/kg)；F：(LPS+Vit D)3组(25 μg/kg) 图 1 各组大鼠肺组织病理 Figure 1 Pathological changes of lung tissue in rats of each group |
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比较上述6组各组VDR和ACE2 mRNA的相对表达量结果见表 2。
| 组别(n=6) | VDR mRNA 相对表达量 | ACE2 mRNA 相对表达量 |
| NC组 | 1.044±0.079bc | 0.782±0.019bc |
| LPS组(5 mg/kg) | 0.822±0.017ab | 0.526±0.002ab |
| Vit D组(25 μg/kg) | 1.193±0.057ac | 0.806±0.027ac |
| (LPS+Vit D)1组(1 μg/kg) | 0.884±0.005ab | 0.534±0.005ab |
| (LPS+Vit D)2组(5 μg/kg) | 0.932±0.019abc | 0.563±0.003abc |
| (LPS+Vit D)3组(25 μg/kg) | 0.971±0.129abc | 0.671±0.002abc |
| 注：与NC组比较，aP < 0.05，与Vit D组比较，bP < 0.05，与LPS组比较，cP < 0.05，VDR mRNA相对表达量(LPS+Vit D)1~3组组间差异无统计学意义，P=0.159，ACE2 mRNA相对表达量(LPS+Vit D)1~3组组间差异有统计学意义，P < 0.05 | ||
比较上述6组各组VDR和ACE2蛋白的相对表达量，结果见表 3，图 2。
| 组别(n=6) | VDR蛋白 相对表达量 | ACE2蛋白 相对表达量 |
| NC组 | 0.771±0.018bc | 0.580±0.009bc |
| LPS组(5 mg/kg) | 0.585±0.004ab | 0.374±0.004ab |
| Vit D组(25 μg/kg) | 0.815±0.004ac | 0.606±0.004ac |
| (LPS+Vit D)1组(1 μg/kg) | 0.587±0.001ab | 0.376±0.004ab |
| (LPS+Vit D)2组(5 μg/kg) | 0.604±0.001abc | 0.424±0.004abc |
| (LPS+Vit D)3组(25 μg/kg) | 0.625±0.001abc | 0.456±0.003abc |
| 注：与NC组比较，aP < 0.05，与Vit D组比较，bP < 0.05，与LPS组比较，cP < 0.05，VDR mRNA相对表达量(LPS+Vit D)1~3组组间差异无统计学意义，P=0.176，ACE2 mRNA相对表达量(LPS+Vit D)1~3组组间差异有统计学意义，P < 0.05 | ||
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| 图 2 各组VDR和ACE2蛋白的表达 Figure 2 Expression of VDR and ACE2 protein in each group |
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ALI是临床常见危重症，其主要的病理特征表现为肺泡及肺微血管内皮细胞的弥漫性损伤。其损伤机制主要是由于LPS致机体过度炎症反应及促凝、抗纤溶的交叉激活[9]。RAS系统是机体的一个重要体液调节系统，其主要由ACE-AngⅡ-AT1轴和ACE2-Ang (1-7)-Mas两条轴组成，其中ACE2是RAS系统中的负调节途径，作用和血管紧张素转化酶(ACE)相反[10]。RAS系统不仅在维持水电解质平衡及心血管稳定方面具有重要的功能，还参与机体的炎症及免疫等功能。近年来RAS系统与ALI发病机制的关系引起广泛关注，笔者研究发现[11]肺微血管内皮细胞AngⅡ的表达水平增高与LPS致大鼠ALI的发病机制密切相关，并且AngⅡ-I型受体(AT1)拮抗剂(ARB)可减轻其肺损伤程度[12]；研究还发现，LPS可下调肺组织中ACE2的表达，而ARB可抑制其下调作用[13]。
VDR是一类核受体，存在于体内多种组织和细胞中，如小肠、骨骼、肾脏、肺、单核细胞、T细胞以及肿瘤细胞等，Vit D通过VDR介导，主要参与机体免疫反应、细胞生长和凋亡等多种过程[14]。
有研究发现，血循环中RAS活性与体内1, 25-(OH)2-D3水平密切相关，即Vit D水平与血浆肾素活性及AngⅡ含量呈负相关[15]，VDR敲除小鼠肾素活性和循环中AngⅡ的浓度明显提高[16]，此外在体外实验中，1, 25-(OH)2-D3通过VDR，能够显著下调As4.1细胞肾素mRNA水平，对肾素基因的转录起负性调节作用[17]。由此说明Vit D可能通过抑制局部及细胞RAS活性从而对病理生理过程进行调控。
本研究在LPS诱导大鼠ALI模型基础上，采用不同浓度的骨化三醇干预后，观察各组大鼠一般情况(实验干预期间的饮食状况、毛色、精神状况、口鼻血性分泌物等表现)、肺组织病理及计算肺干/湿重比；分别检测肺组织中ACE2和VDR蛋白及基因水平表达的变化情况。关于骨化三醇灌胃浓度的选择，参考了Zhang等[18]对海水误吸致大鼠ALI模型中骨化三醇组的处理内容，该研究发现骨化三醇可介导VDR mRNA的表达抑制TNF-α，IL-1β和IL-6等炎症因子的分泌，从而缓解大鼠ALI模型中大鼠肺组织的水肿情况尤其在灌胃浓度25 μg/kg时最为显著，呈剂量依赖性。因此，外源性补充Vit D，能否通过VDR介导增加ACE2的表达，从而对ALI发挥保护作用，目前未见相关研究报道。
本次实验发现LPS组大鼠一般情况最差，肺干/湿质量比显示肺组织水肿、渗出严重，肺组织病理示肺泡壁破裂、融合伴大量炎性细胞浸润，提示本次实验大鼠ALI造模成功。相比较于NC组，(LPS+Vit D)1~3组和LPS组大鼠肺组织病理、肺干/湿重比及一般情况均较NC组较差，但(LPS+Vit D)1~3组较LPS组有明显的改善，但是差于Vit D组。(LPS+Vit D)1~3组大鼠随骨化三醇灌胃浓度的增加，肺组织病理结果显示骨化三醇各亚组均可以不同程度改善大鼠ALI的进展，并且伴ACE2蛋白及基因水平表达的增高，在(LPS+Vit D)1~3组组间比较差异有统计学意义(P < 0.05)。其中骨化三醇各亚组间VDR蛋白及基因在表达相对量上呈上升趋势，但组间差异无统计学意义(P＞0.05)。本研究发现，随着外源性Vit D补充的增加，VDR和ACE2在蛋白及基因水平均为高表达，ACE2作为ALI的保护因素，其作用在于水解AngⅡ生成Ang (1-7)，Ang (1-7)亦可通过阻断AngⅡ对LPS引起的机体损伤起保护作用。Ferrario等[19]研究发现血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)或ARB可使大鼠肾脏组织ACE2的表达及活性明显增加，并提出ACE2活性的增加在于ACEI或ARB抑制了AngⅡ的合成。并且血浆Vit D水平与血浆肾素活性及AngⅡ含量呈负相关，对RAS系统起抑制作用。笔者推测，外源性Vit D的增加和ACE2表达的增加可能存在一定的关系，即在ALI中，Vit D可通过VDR抑制AngⅡ的表达从而上调肺组织中ACE2的活性对ALI的发生发展起负性调节作用，Vit D可能对LPS诱导的大鼠ALI有保护作用。
综上所述，Vit D能使LPS致ALI大鼠肺组织中VDR和ACE2的表达增加，从而对ALI的发生发展起保护作用。但由于ALI病理机制复杂，Vit D干预的具体信号通路未明，故仍需进一步研究。
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