2016, Vol. 25
复苏后心功能不全(post-resuscitation myocardial dysfunction, PRMD)是心搏骤停心肺复苏(CPR)后严重、可逆性心肌收缩和舒张功能障碍，或被认为“心肌顿抑”。随着心肌缺血时间延长，继之再灌注过程激活了细胞内一系列反应，可导致顿抑心肌细胞发生程序性死亡异常增加[1]，加重了心肌受损并诱发心衰，是自主循环恢复(ROSC)患者早期死亡的重要原因[2]。
一氧化碳(carbon monoxide, CO)以往被认为是与血红蛋白高度亲和，抑制呼吸功能的毒性气体。但近年的许多研究已证实体内血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)催化血红素生成的内源性CO是维持细胞稳态、促进存活的重要气体信使[3]，发挥了抗凋亡、抗氧化应激、抗炎症等多重心肌保护效应[4]。2002年，Motterlini和Clark等[6]成功合成了过渡金属羰基化合物，命名为一氧化碳释放分子(carbon monoxide-releasing molecules, CORMs)。CORMs能稳定释放CO，可作用于特定的靶组织，有明确的药代动力学特征，其中CORM-2是第二代CORMs化合物。本研究拟建立大鼠室颤法心搏骤停心肺复苏模型，观察CORM-2对复苏后心肌的保护作用并初步探讨可能的机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物、试剂及仪器 1.1.1 实验动物健康雄性SPF级Sprague-Dawley大鼠，体质量450~550 g，均由中山大学大学实验动物中心提供(许可证号：SCXK 2011-0029)。
1.1.2 主要试剂一氧化碳释放分子(CORM-2)(美国Sigma-Aldrich公司)，组织线粒体分离试剂盒(碧云天生物科技公司)，线粒体呼吸控制率(RCR)检测试剂盒(美国GENMED SCIENTIFICS公司)，兔抗鼠激活型caspase-3(cleaved caspase-3)多克隆抗体(英国Abcam公司)，兔抗鼠细胞色素C (cytochrome C, cyt c)单克隆抗体(英国Abcam公司)，兔抗鼠β-actin多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)。
1.1.3 主要仪器和器械小动物心肺复苏机械装置[(中山大学心肺脑复苏研究所(专利号:ZL 2006 20063261.9)]，Windaq数据采集系统(美国DATAQ公司), 心脏彩色多普勒超声诊断仪(加拿大VEVO2100)，Oxytherm液相氧电极(英国Hansatech)，Western Blot转印电泳系统(美国BIO-RAD)，凝胶成像系统(美国BIO-RAD)。
1.2 实验方法 1.2.1 试剂的制备及实验分组电子分析天平称CORM-2质量，将其溶解于含0.2%二甲基亚枫(DMSO)生理盐水溶液，药物总体积为1 mL，上述试剂每次使用新鲜配制。无活性形式(inactivated CORM-2, iCORM-2)的制备需将CORM-2溶解于0.2% DMSO，并静置于含5% CO2，37℃环境中18 h，使其释放出CO。溶解iCORM-2的DMSO溶液可短期储存备用，每次使用前再予95%氮气预冲15 min。
27只SD大鼠随机(随机数字法)分为4组：模型组Control组(n=8)、CORM-2组(n=8)、iCORM-2组(n=8)及假手术(Sham)组(n=3)。Sham组进行复苏以外的所有操作，包括气管插管、动静脉置管等。复苏失败或复苏成功未存活至预设时间点者，不计入组。ROSC后CORM-2组、iCORM-2组分别即予等体积(1 mL)50 μmol/kg CORM-2、iCORM-2；Control组及Sham组予等体积0.2% DMSO溶液。
1.2.2 动物模型建立及取材参照文献[7]，建立大鼠致颤法心搏骤停心肺复苏动物模型。SD大鼠术前晚禁食但不禁水，戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔内麻醉，备皮，仰卧位固定，经口直视插入14号气管鞘管，外接红外线呼气末二氧化碳监测仪监测呼气末二氧化碳分压(end-tidal carbon dioxide partial pressure，PETCO2)。左股动脉置入23号PE-50聚乙烯管监测主动脉压，左股静脉同样方法置入23号PE-50聚乙烯管输注药物，右颈外静脉置4 F鞘管至右心房，鞘管前端弯曲的指引钢丝(正极)触及右心室内膜，皮下插入针头(负极)，正负极形成回路而诱发室颤。持续记录肢体Ⅱ导联心电图，维持肛温在(36.8±0.2)℃。以最大递增至3 mA交流电诱导心室颤动，持续刺激3 min撤除，并维持未处理的室颤8 min。Control组采用心肺复苏装置进行频率为250次/min的胸外按压和50次/min的同步机械通气，吸入氧浓度为100%，按压深度以维持主动脉舒张压(diastolic blood pressure, DBP)(26±2) mmHg (1 mmHg=0.133 Kpa)为依据。持续胸外按压6 min后, 给予连续最多3次2J双相波除颤。ROSC定义为恢复室上性心律，平均动脉血压(mean arterial pressure, MAP)≥60 mmHg，并持续5 min以上。监测血流动力学至ROSC 3 h，后动物拔管归笼。复苏后12h各组动物麻醉状态下行超声心电图检查后，采用罗氏Cobas b123血气分析仪电极法检测血清碳氧血红蛋白(carbonyl hemoglobin, CoHb)含量，后立即处死，摘取心脏分离线粒体，行线粒体功能监测；同时获取胞质(去除线粒体部分)，-80 ℃冰箱保存，备行Western blot实验。
1.2.3 心脏超声心电图应用彩色超声多普勒诊断仪(探头频率16~21 mHz)对各组大鼠收缩及舒张功能的进行评估。大鼠取胸骨旁左室长轴及乳头肌平面的短轴，应用心尖四腔观单平面面积-长度法测量出射血分数(ejection fraction，EF)。同一心动周期分别测量等容舒张时间(isovolumic relaxation time, IVRT)、等容收缩时间(isovolumetric contraction time，IVCT)及射血时间(ejection time, ET)，根据公式心肌做功指数(myocardial performance index，MPI)=(IVRT+IVCT)/ET。测量3个不同心动周期取平均值。
1.2.4 心肌线粒体分离全程0~4 ℃冰水浴中进行。新鲜的心肌组织，称质量后放入预冷的Dounce匀浆器。差速离心法最终获取沉淀，加入分离介质重悬线粒体，置于冰槽保存待检；上清夜即为去除线粒体的胞浆蛋白，-80 ℃冰箱备行Western blot检测。
1.2.5 线粒体呼吸功能测定采用Clark氧电极法[8]。室温下校准后，反应槽内加入2.5 mL介质液，基线平稳后加入20 μL线粒体悬液，记录1 min后加入Ⅳ态底物液，测的氧消耗率为Ⅳ态呼吸(R4)，2 min后加入Ⅲ态底物液，测的氧消耗率为Ⅲ态呼吸(R3)。线粒体呼吸控制率(respiratory control rate，RCR)=R3/R4。
1.2.6 Western blot法检测线粒体及胞质蛋白每例样品取50 μg蛋白经SDS-PAGE电泳分离，将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉4 ℃非特异性封闭，TBST冲洗后，加入兔抗大鼠caspase-3抗体(1: 500)、cytc抗体稀释液(1: 500)或β-actin抗体稀释液(1: 1000)，4 ℃摇床过夜。TBST溶液振摇洗3次，每次5 min。加入二抗室温孵育1 h，洗膜。加入显色液，室温反应约5 min，滤纸吸去多余底物溶液，显影照相分析结果。以β-actin蛋白作为上样量参照。
1.2.7 统计学方法应用SPSS 20.0统计软件进行统计分析。正态分布数据用均数±标准差(x±s)表示，非正态分布数据用中位数表示。多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA或Kruskal-WallisH检验，之后的两两比较用Bonferronni’ post hoc检验，以P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 各组大鼠生理参数比较各组大鼠体质量、平均动脉压(MAP)、心率(HR)、PETCO2、肛温及血气指标等基线值的比较，组间差异无统计学意义(P＞0.05，表 1)。CPR期间以及ROSC 3 h内常规血流动力学监测，组间差异无统计学意义(P＞0.05，表 2, 3)。复苏后3 h内，大鼠MAP较基础值下降(P < 0.05，表 3)，HR在ROSC 1 h已恢复，较基础值差异无统计学意义(P＞0.05，表 3)。
| 指标 | Control组 (n=8) | CORM-2组 (n=8) | iCORM-2组 (n=8) | Sham组 (n=3) |
| 体质量(g) | 505±15 | 507±24 | 498±25 | 490±23 |
| 心率(次/min) | 358±38 | 368±32 | 362±33 | 375±35 |
| MAP (mmHg) | 138±13 | 146±21 | 140±16 | 135±19 |
| PETCO2 (mmHg) | 41±3 | 39±3 | 40±3 | 42±4 |
| 肛温(℃) | 36.9±0.1 | 37.1±0.3 | 37.0±0.2 | 36.8±0.2 |
| pH | 7.42±0.02 | 7.40±0.04 | 7.41±0.03 | 7.45±0.03 |
| PaCO2 (mmHg) | 40.1±3.1 | 38.2±2.5 | 40.1±4.2 | 37.5±2.5 |
| PaO2 (mmHg) | 91.2±11.0 | 95.4±10.0 | 93.1±9.0 | 96.0±13.0 |
| 注：MAP，平均动脉压；PETCO2，呼吸末二氧化碳分压；PaCO2，动脉二氧化碳分压；PaO2，动脉氧分压 | ||||
| 组别 | DBP (mmHg) | PETCO2 (mmHg) | ||||
| PC 2 min | PC 4 min | PC 6 min | PC 2 min | PC 4 min | PC 6 min | |
| Control组 | 27.5±1.5 | 26.0±1.1 | 27.0±1.2 | 14±3 | 16±2 | 15±4 |
| CORM-2组 | 26.3±2.2 | 26.3±1.5 | 25.8±1.9 | 13±2 | 15±3 | 16±3 |
| iCORM-2组 | 26.8±1.2 | 24.8±1.5 | 25.5±1.3 | 15±2 | 17±4 | 13±3 |
| Sham组 | 120±15 | 122±18 | 116±20 | 39±3 | 40±4 | 41±3 |
| 注：DBP，主动脉舒张压；PETCO2，呼吸末二氧化碳分压；PC，胸外按压 | ||||||
| 组别 | MAP (mmHg) | HR (次/min) | ||||
| ROSC 1h | ROSC 2h | ROSC 3h | ROSC 1h | ROSC 2h | ROSC 3h | |
| Control组 | 93±9a | 106±10a | 117±12a | 358±40 | 349±35 | 360±34 |
| CORM-2组 | 90±13a | 99±15a | 108±19a | 353±32 | 350±37 | 366±30 |
| iCORM-2组 | 98±12a | 105±11a | 115±13a | 363±28 | 377±42 | 370±36 |
| Sham组 | 140±18 | 132±15 | 144±20 | 369±33 | 356±34 | 361±27 |
| 注：MAP，平均动脉压；HR，心率；ROSC，自主循环恢复；与Sham组比较，aP < 0.05 | ||||||
ROSC 12 h，各复苏组心脏功能包括EF值、MPI值较Sham组明显减退(P < 0.05)。CORM-2组的EF值较Control组增高29%，MPI值较Control组降低35%(P < 0.05)；iCORM-2组EF值、MPI值与Control组的相应值比较，组间差异无统计学意义(P＞0.05)(图 1)。
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| EF, 射血分数；MPI, 心肌做功指数；与Sham组比较, aP < 0.05;与Control组比较, bP < 0.05 图 1 复苏后12 h超声心动图测量左心室功能参数 Figure 1 Comparison of ejection fraction (EF, %) and myocardial performance index (MPI) among the groups at 12 hour post-resuscitation |
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ROSC 12 h，各复苏组线粒体呼吸功能较Sham组明显减低(P < 0.05)。CORM-2组线粒体Ⅲ态呼吸速率及RCR值与Control组的相应值比较明显增高，差异具有统计学意义(均P < 0.05)；iCORM-2组的呼吸功能指标与Control组比较，组间差异无统计学意义(均P＞0.05)。Ⅳ态呼吸速率各组间比较，差异无统计学意义(P＞0.05)(表 4)。
| 指标 | Control组 | CORM-2组 | iCORM-2组 | Sham组 |
| Ⅳ态(nmol of O/min/mg mitochondrial protein) | 31.0±1.6a | 30.9±1.7a | 30.8±2.5a | 34.5±1.3 |
| Ⅲ态(nmol of O/min/mg mitochondrial protein) | 103.2±7.0a | 159.5±5.0ab | 108.6±8.0a | 221.7±6.0 |
| RCR | 3.3±0.09a | 4.8±0.06ab | 3.5±0.12a | 6.5±0.39 |
| 注：RCR，呼吸控制率；与Sham组比较, aP < 0.05;与Control组比较, bP < 0.05 | ||||
ROSC 12 h，与Sham组比较，各复苏组胞浆cyt c及caspase-3表达明显增加(P < 0.05)。与Control组比较，CORM-2组胞浆/线粒体cyt c比例降低27.8%，caspase-3降低30%，差异具有统计学意义(P < 0.05)。iCORM-2组上述蛋白表达与Control组比较，组间差异无统计学意义(P＞0.05)(图 2)。
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| (A) Western blot检测蛋白水平；(B)光密度法测定结果；与Sham组比较, aP < 0.05;与Control组比较, bP < 0.05 图 2 复苏后12 h各组心肌组织线粒体及胞浆cyt c和caspase-3表达 Figure 2 Detection of cytochrome c release and caspase-3 expression in myocardium by western blot analysis at 12 hour post-resuscitation |
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CORM-2干预后，各组复苏后12 h血清碳氧血红蛋白百分数(FCOHb)与Sham组比较，组间差异无统计学意义(P＞0.05)(图 3)。
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| 与sham组比较, aP < 0.05;与Control组比较, bP < 0.05 图 3 复苏后12 h各组血清CoHb含量比较 Figure 3 Comparison of carbonyl hemoglobin among the groups at 12 hour post-resuscitation |
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本实验表明复苏后大鼠即予CORM-2干预，ROSC 12 h心功能及线粒体呼吸功能较Control组明显改善；同时，CORM-2降低了心肌组织胞浆中cyt c，caspase-3等线粒体途径的细胞凋亡相关蛋白的表达。实验中使用的无活性CORM-2或DMSO溶液对凋亡无影响，提示CORM-2可能是通过释放CO，抑制内源性细胞凋亡途径，改善复苏后心功能不全。由于高剂量CORMS所含的钌基浓度增加，可抑制线粒体呼吸酶活性，产生细胞毒性、增加细胞凋亡[9]，本研究采纳了50 μmol/kg中等剂量组。此剂量未增加血清CoHb含量且血流动力学无变化，提示50 μmol/kg CORM-2释放出CO在复苏领域可能有较好的临床应用价值。
细胞凋亡是否参与复苏后心功能不全的发生发展目前仍存在一些争议。Gu等[10]在猪8 min电诱发室颤模型中，ROSC后12 h、24 h，Bcl-2/Bax降低，caspase-3 mRNA表达水平上调，蛋白活性增加，ROSC 24 h心肌出现典型的凋亡细胞核。这提示caspase-3介导的凋亡通路的激活可能是心搏骤停复苏后心肌损伤的病理机制之一。除基础研究外，临床成功复苏的患者血液中检出早期凋亡annexin V阳性细胞，也提示了凋亡参与了复苏后综合征病理过程[11]。但Son等[12]在大鼠ROSC 4 h，心肌组织TUNEL阳性细胞率与对照组差异无统计学意义，提出凋亡不参与复苏后心功能不全；也有学者提出复苏过程caspase-3凋亡通路的激活并不伴随着核小体间DNA片段化，而使用caspase-3抑制剂并不改善复苏后心功能不全[13]。DNA梯度虽然是凋亡细胞死亡的标志，但阴性结果不能排除早期凋亡的发生。这些矛盾的结果可能与凋亡检测的方法、观察时间的差异有关。
目前CO改善心肌细胞线粒体呼吸、抑制细胞凋亡的具体机制或可能的信号转导途径未完全阐明。心肌局部缺血-再灌注损伤模型中，外源性CORM降低了凋亡标志物，包括：lamin A, caspase-3和PARP-1等的降解产物的表达；增加了心肌保护蛋白血红素氧化酶(HO-1)、环氧酶-2(COX-2)、细胞外超氧化物歧化酶(extracellular superoxide dismutase, Ec-SOD)和线粒体通路介导的抗细胞凋亡蛋白(MCL-1)表达，抑制凋亡，发挥心肌保护作用[14]。笔者前期的体外实验也证实，低剂量的CORM-2能部分减少线粒体BAK/BAX比例及胞浆BAX表达，减轻氧糖剥夺-氧糖恢复诱导的心肌细胞凋亡[15]。由此提出，CORM-2可能是部分通过降低bcl-2促凋亡蛋白表达，维持线粒体膜电位和膜完整性，促进线粒体氧化和磷酸化偶联，改善心功能。基因和生化方面研究发现，线粒体外膜存在代谢物质交换的重要通道-电压依赖性阴离子通道蛋白-2(voltage-dependent anion channel-2, VDAC2)，能与促凋亡蛋白BAK结合，使后者失活而拮抗凋亡发生[16]。进一步研究将讨论复苏后BAK-VDAC2复合物结合状态对凋亡的影响。
在缺血-再灌注损伤的动物模型中发现，外源性低剂量CO直接吸入或通过CORMS释放可控剂量的CO能有效发挥抗凋亡、抗炎、抗氧化应激以及血管活性效应[17-18]。溶解于DMSO的CORM-2半衰期约20 min，而CO直接释放需要更长的起效时间，这在后者的临床应用上受到局限。在剂量方面，目前体内实验中多采用吸入100~250 10-6 CO数小时或数天，相当于空气中毫摩尔级CO，使血CoHb含量增加1%~10%不等[19]；相反，CORMs常用的剂量产生微摩尔级的CO，模拟了内源性CO产生的动力学，相比更为安全[20]。这些均提示CORMs在复苏领域可能有较好的应用前景。在本实验中，CORM-2并不影响复苏后血流动力学改变及增加血清CoHb含量，但仍需要大量临床前研究进一步评价其应用价值。
本研究结果提示，CORM-2可能是通过释放CO，抑制线粒体途径的心肌细胞凋亡能够改善线粒体呼吸功能及复苏后心肌收缩和舒张功能。中等剂量(50 μmol/kg) CORM-2不影响血液动力学及CoHb水平。
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