自噬是细胞受到刺激后，通过溶酶体途径降解细胞内物质的统称，广泛存在于真核细胞中，主要负责长半衰期蛋白及细胞器的降解和再利用，以电镜下出现大量双层膜结构的自噬体为特征。自噬存在于脑缺血病灶中，但作用仍不明确，可能具有双刃剑作用，氨基酸尤其是亮氨酸、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是自噬的重要调控因子。为探讨局灶性脑缺血中自噬病变的调节机制，本实验拟通过亮氨酸干预，观察其对mTOR的表达及脑缺血自噬病变的影响。

健康雄性SD大鼠54只，体质量(250±30) g，清洁级，由南昌大学医学院动物科学部提供。喂养条件：6只一笼，室温22 ℃，湿度50%~60%，通风良好，采取木材锯末做垫层，使用全价营养颗粒饲料及消毒灭菌水喂养，昼夜节律12 h。大鼠随机(随机数字法)分为3组：生理盐水组(NS组)、葡萄糖组(GS组)、亮氨酸组(AA组)，每组18只；造模成功后再依据缺血时间不同分为6 h、12 h、24 h三个亚组，每亚组6只；各亚组再随机选取3只进行Western blot检测，另外3只进行免疫组化分析。

Phospho-mTOR (Ser2448) Antibody (Bioworld公司)，LC3Ⅰ/Ⅱ Rabbit mAb (Cell signaling公司)，L-Leucine (sigma公司)，羊抗兔二抗工作液、免疫组化检测试剂(中杉金桥)，Leica2235切片机(Leica公司)，显微镜照相系统(Olympus公司)。

参照文献[1]线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞模型(MCAO)，术前禁食12 h不禁饮，将大鼠称重后用2%戊巴比妥(4 mg/100 g)腹腔注射麻醉，固定头部及四肢。采用颈正中切口，术野备皮、碘伏消毒，纵向切开皮肤，钝性分离暴露右侧颈动脉鞘，游离右侧颈总动脉、迷走神经、颈外动脉和颈内动脉。结扎颈外动脉，在颈总动脉近分叉处缓慢地插入线栓，进入深度约18~20 mm，固定线栓后取大鼠锁骨中点上方为手术区，切开分离并暴露颈内静脉，以1 mlL针头穿刺静脉，回抽有血后固定针头，依据分组抽取0.9%氯化钠、5%葡萄糖、1.5%亮氨酸各5 mL分别向颈内静脉灌注，完毕后拔出穿刺针，棉球压迫止血。手术结束后剪断结扎线，逐层缝合后大鼠回笼。整个麻醉期间，控制大鼠肛温在37 ℃左右。模型成功的判定标准：各组大鼠术后出现脑栓塞对侧肢体的活动或行走障碍。

建模成功后至相应缺血时间段，深度麻醉大鼠，剪开胸腔暴露心脏，将输液器穿刺针一端由心尖插入升主动脉，剪开右心耳，先后用生理盐水、4%多聚甲醛全身灌注固定，切取缺血侧脑组织，放入4%多聚甲醛溶液中4℃冰箱保存24 h；常规石蜡包埋，5 μm连续切片，用3%的过氧化氢暗处浸泡10 min，PBS洗3×5 min，微波修复抗原；一抗孵育：在含1%血清的PBS中加入一抗4 ℃过夜，PBS洗3×5 min (抗体稀释比例GATA3 1：200 ROR 1：50 T-bet 1：50)；相应的B液及C液室温孵育各30 min，PBS洗3×5 min；DAB室温显色8~12 min，苏木精复染1 min，自来水中返蓝5 min，脱水透明，树胶封片。结果分析：阳性细胞胞浆呈棕黄色，核呈紫蓝色。采用Image-Pro Plus软件测量平均吸光度值(AOD)：AOD值=累计吸光度值(IOD)/测量区域面积。

建模成功后至相应缺血时间段，深度麻醉处死大鼠，切取缺血侧脑组织，提取总蛋白，BCA法测定蛋白总浓度，样品经SDS-PAGE电泳，根据Marker定位目标蛋白区域切胶，经电泳转膜、脱脂奶粉封闭后，加入一抗4℃孵育过夜(GATA3 1：1 000；ROR 1：1 000；T-bet 1：1 000；β-actin 1：1 000)，TBST洗3×5 min。相应二抗室温孵育1 h (1：2 000)，TBST洗3×5 min。化学发光剂(ECL)检测转印膜上靶蛋白信号。胶片晾干后扫描，使用Image-Pro Plus 6.0软件处理系统对条带作灰度值分析：目的蛋白灰度=目的蛋白IOD值/相应内参IOD值。

采用SPSS 18.0统计软件包进行数据分析，所得计量数据均以均数±标准差(x±s)表示，多样本均数比较采用方差分析(ANOVA方差分析)，两两比较使用LSD-t检验，以P < 0.05为差异具有统计学意义。

在缺血24 h时各处理组间差异无统计学意义(P > 0.05)，在6 h、12 h时，亮氨酸组中mTOR表达较生理盐水组、葡萄糖组高，差异有统计学意义(P < 0.05)。见图 1、图 2。

图A~C依次为NS、GS、AA组6 h时的免疫组化图；D~F依次为NS、GS、AA组12 h时的免疫组化图；G~I依次为NS、GS、AA组24 h时的免疫组化图 图 1 各组mTOR蛋白免疫组化染色图

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图 2 免疫组化法测定mTOR表达变化

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在缺血6 h时各处理组间差异无统计学意义(P > 0.05)，在缺血12 h时亮氨酸组中LC3-Ⅱ表达较生理盐水、葡萄糖组低，差异具有统计学意义(P < 0.01)；在缺血24 h时，亮氨酸组中LC3-Ⅱ表达较生理盐水组低，差异具有统计学意义(P < 0.05)，与葡萄糖组比较差异无统计学意义(P > 0.05)。见图 3、图 4。

图A~C依次为NS、GS、AA组6 h时的免疫组化图；D~F依次为NS、GS、AA组12 h时的免疫组化图；G~I依次为NS、GS、AA组24h时的免疫组化图 图 3 各组LC3-Ⅱ蛋白免疫组化染色图

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图 4 免疫组化法测定LC3-Ⅱ表达变化

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在缺血6 h、12 h、24 h三个时间段，亮氨酸组中mTOR的表达均较生理盐水及葡萄糖组高，差异均具有统计学意义(P < 0.05)，而LC3-Ⅱ的表达均较生理盐水及葡萄糖组低，差异均有统计学意义(P < 0.05)。见图 5-7。

图 5 各实验组mTOR、LC3-Ⅱ蛋白Westem blot结果

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图 6 Westem blot法测定mTOR表达变化

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图 7 Westem blot法测定LC3-Ⅱ表达变化

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自噬是细胞受到刺激后，通过溶酶体途径降解细胞内物质的统称。自噬不仅因为其具有复杂的蛋白质、脂质降解过程^[2-3]，还因为受氨基酸、能量代谢、mTOR等信号因子转导调控及其调节异常引发的病理生理学改变而为人们所关注^[4-5]。mTOR在细胞内至少存在两种不同的复合体：mTORC1和mTORC2，这两种复合体均可被丝裂原激活，但只有mTORCl受营养、能量、激素等信号的控制且对雷帕霉素(可抑制mTORC1)敏感^[6]。mTORCl的调节相关蛋白Raptor连接了TOR信号基序(TOS)、40S核糖体S6蛋白激酶(P70 ribosomal protein S6 kinases，p70S6K)和真核启动因子4E结合蛋白1(eukaryotic initiation factor 4E binding protein 1，4EBP1)，可将底物提呈给mTOR的激酶区域以优化下游靶点的磷酸化过程发挥抑制自噬、促进蛋白合成、调节细胞生长和增殖等功能^[7-12]。对大多数外周脏器的研究表明，mTOR调节自噬通路中，氨基酸具有重要作用^[13-14]。通过对肝细胞研究发现，混合氨基酸抑制自噬并且快速促进核糖体蛋白S6的磷酸化，撤去氨基酸或添加雷帕霉素可以对S6蛋白起到快速去磷酸化作用。同时, 亮氨酸是各类氨基酸中刺激mTOR的最有效信号因子，如Krause等^[15]在肝细胞中利用谷氨酰胺和亮氨酸证明了这点。

然而，在中枢神经系统中，自噬病变的影响因素研究较少。本实验通过Zealonga线栓法制备大鼠MCAO模型，通过颈静脉灌注亮氨酸并在缺血6 h、12 h、24 h分别检测mTOR、LC3-Ⅱ的表达，结果表明，在脑缺血发生后6~24 h内，亮氨酸促进mTOR的表达，减弱LC3-Ⅱ的表达。LC3定位在前自噬泡与自噬泡膜的表面，与酵母基因ATG8同源，细胞中的LC3合成加工后变成胞浆内可溶性的LC3-I，经泛素化加工，与自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)结合，转变为LC3-Ⅱ后被转运定位在自噬体膜上，故可通过检测LC3-Ⅱ的水平来反应自噬体的数量，因而被广泛用作检测自噬水平的指标^[16-17]。因此推测，亮氨酸本身或通过刺激mTOR的表达可以对脑缺血自噬病变有一定抑制作用。

目前自噬在脑缺血中的作用仍不明确。Sheng等^[18]、Su等^[19]建立脑缺血模型并给予缺血预处理，结果显示缺血预处理可以激活自噬-溶酶体通路并对缺血灶的神经损伤具有保护作用，自噬抑制剂三甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)可逆转神经保护作用，而雷帕霉素可改善脑缺血损伤；然而，Xing等^[20]、Zheng等^[21]下调自噬基因的表达，均观察到脑梗死灶缩小、组织损伤和神经功能障碍减轻等表现。

尽管自噬在脑缺血中的确切作用仍有争议，但毫无疑问，自噬在脑缺血发生后对于调控神经细胞的存活具有重要作用。虽然本次研究结果尚不能确定自噬在脑缺血中的作用，但综合目前研究资料表明，脑缺血发生后对蛋白质、脂类和细胞内各成分均具有损害作用，作为一种修复机制，自噬被激活，以消除积累在神经细胞内受损的组织成分，在这个阶段，自噬可能促进细胞生存。如果缺血应激时间较长，细胞内受损或功能障碍的大分子和细胞器增加，神经细胞不能去除所有的自噬体恢复到基础状态，最终可能诱导神经细胞死亡而加重脑损害。