创伤性脑损伤(traumatic brain injury, TBI)后的继发性脑损伤是影响患者预后的重要因素之一^[1-3]，其中TBI后的炎性反应在继发性脑损伤中发挥重要作用^[4]。核因子κB (nuclear transcription factor kappa B, NF-κB)可调控多种细胞因子和炎症介质表达，是参与脑继发性反应的一个重要信号转导分子^[5]。白介素17A (IL-17A)可通过不同途径调节微环境中的细胞因子、趋化因子、黏附性分子的表达，从而促进炎性细胞的聚集和慢性炎症^[6]。同时，IL-17A还可通过激活转录因子NF-κB介导并放大炎症，从而发挥其生物学效应^[7-8]。本实验通过建立大鼠TBI模型，采用Western Blot技术、水迷宫及平衡木试验(beam balance test, BBT)，并使用可抑制IL-17A产生的免疫调节剂Y320干预TBI后继发性炎症反应，揭示细胞因子IL-17A在继发性脑损伤中的作用及相关机制。

成年雄性Wistar大鼠(体质量250~300 g)，由山东济宁鲁康动物公司提供。随机(随机数字法)将其分为7组：对照组(n=6)、假手术组(sham组)(n=6)、TBI组(n=24)、sham+生理盐水组(sham+NS组)(n=6)、sham+Y320组(n=6)、TBI+NS组(n=6)和TBI+Y320组(n=6)。TBI组内随机(随机数字法)分为12 h、24 h、3 d、7 d四个亚组。sham组只开颅而不致伤。sham+Y320组和TBI+Y320组大鼠于术后按525 μg/kg的剂量给予腹腔注射Y320^[9]。主要试剂：NF-κB p65兔单克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司)、IL-17A兔多克隆抗体(美国Abcam公司)、Y320(美国Selleck生物科技有限公司)。

大鼠创伤性脑损伤的建立依据Feeney自由落体模型制作^[10]。大鼠麻醉后固定于脑立体定位仪上，暴露顶骨，用牙科钻于前后囟之间、中线右侧旁开2.5 mm处钻开颅骨，形成直径约4 mm的骨窗，保持硬脑膜完整。将20 g砝码于30 cm高处通过导向管坠落(打击力为600 g/cm²)，撞击置于硬脑膜上的金属垫片致中度脑损伤。术后自由活动与进食。

术后于各个时间点迅速处死大鼠取脑，检测损伤部位周围大脑皮质内IL-17A及NF-κB p65蛋白的表达。冰上分离大脑皮质置于冻存管内，-80 ℃保存备用。经过样本处理，聚丙酰胺凝胶制备后上样与蛋白电泳，转膜，漂洗封闭，依次放入一抗、二抗，显色，照相，采用Image Pro Plus图像分析系统对蛋白条带的相对表达进行分析。

进行正式测试前，先对大鼠进行游泳及寻找可视平台训练，并在TBI后1 d、3 d、5 d、7 d进行测试。将透明平台置于第三象限，将各组大鼠随机从第一象限面壁置入池内，大鼠登上站台后终止记录，最长记录时间为60 s。若大鼠60 s内未找到平台，则在软件停止计时后由实验者引导其登上平台并停留10 s，此时的逃避潜伏期计为60 s。

该试验用于评定模型大鼠感觉运动整合能力以及平衡协调能力。平衡木长80 cm，宽2.5 cm，平放在距离地面100 cm处。术前1周每天早晚各训练1次，每次10 cm，使其能顺利在平横木上行走。于术后各观察时点观察并评分，每个时间点测试3次，每次间隔5 min，取3次平均值作为当天成绩。

采用SPSS 18.0软件进行统计分析。数据以均数±标准差(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐时，采用SNK-q法检验；方差不齐时，采用Dunnett’ s T3法检验。水迷宫及平衡木实验不同时间点之间的数据比较采用重复测量设计的Two-Way ANOVA (时间为组内因素，处理为组间因素)，以P < 0.05为差异具有统计学意义。采用Graph PAD Prism 5.0软件将实验数据生成统计图表。

TBI后第1天、3天、5天、7天的空间探索实验中，与sham+NS组，sham+Y320组大鼠逃避潜伏期与之差异无统计学意义，而TBI+NS组大鼠逃避潜伏期显著性延长(P < 0.01)。TBI+Y320组在第3天、5天、7天逃避潜伏期较TBI+NS组显著缩短(P < 0.01)，而较sham+Y320组显著延长(P < 0.01)。四组之间在各时间点差异具有统计学意义(P < 0.01)。sham+NS组、sham+Y320组、TBI+NS组三组组内时间点逃避潜伏期比较差异均无统计学意义。TBI+Y320组中除3 d与5 d相比差异无统计学意义，其余两两比较差异均具有统计学意义(P < 0.01)。组内各时间点之间差异有统计学意义(P < 0.01)。(见图 1)

与sham+NS组比较，aP < 0.01；与TBI+NS组比较，bP < 0.01；与sham+Y320组比较，cP < 0.01 图 1 四组大鼠逃避潜伏期的比较 Figure 1 Comparison of the latency to platform area in four groups

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与sham+NS组相比，在TBI后各时间点TBI+NS组BBT评分明显升高(P < 0.01, 1d, 3d, 5d; P < 0.05, 7d)。sham+Y320组与sham+NS组相比，两组BBT评分差异无统计学意义。TBI+Y320组与TBI+NS组相比差异亦无统计学意义。TBI+Y320组较sham+Y320组在各时间点BBT评分均显著增高，差异有统计学意义(P < 0.01, 1d, 3d, 5d; P < 0.05, 7d)。四组之间在各时间点差异具有统计学意义(P < 0.01)。sham+NS组、sham+Y320组两组组内时间点比较差异均无统计学意义。TBI+NS组3d时BBT评分显著高于1 d、5 d、7 d (分别P < 0.05, P < 0.01, P < 0.01)；TBI+Y320组3d时BBT评分显著高于5 d、7 d (分别P < 0.05, P < 0.01)。组内各时间点之间差异有统计学意义(P < 0.01)。(见图 2)

与sham+NS组比较，aP < 0.01, bP < 0.05；TBI+Y320组与sham+Y320组比较，cP < 0.01，dP < 0.05 图 2 感觉运动整合能力以及平衡协调能力评价 Figure 2 Evaluation of the sensorimotor integration ability and the balance coordination ability

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与sham组比较，TBI后24 h、3 d、7 d脑组织中IL-17A的表达明显升高(P < 0.01)；与TBI后12 h组相比，TBI后24 h、3 d、7 d脑组织中IL-17A的表达均有显著增高(P < 0.01, P < 0.01, P < 0.05)。与TBI后3 d组相比，TBI后7 d脑组织中IL-17A的表达明显降低(P < 0.05)。6组之间差异具有统计学意义(P < 0.01)。

与sham组及TBI后12 h组相比，TBI后3 d组脑组织中NF-κB p65的表达明显升高，差异均具有统计学意义(P < 0.05)，(见图 3)。同时，TBI 12 h、24 h、3 d、7 d组的脑组织中IL-17A与NF-κB p65的表达趋势基本一致。(见图 4)6组之间差异具有统计学意义(P < 0.05)。

A:对照组、假手术组及TBI组脑组织中IL-17A、NF-κB p65蛋白表达图谱; B, C:对照组、假手术组及TBI组脑组织中IL-17A、NF-κB p65灰度值(x±s)。与假手术组比较，aP < 0.01，b P < 0.05；与TBI 12 h组比较，cP < 0.01，d P < 0.05；与TBI 3 d组比较，e P < 0.05 图 3 对照组、假手术组及TBI组脑组织中IL-17A、NF-κB p65的表达 Figure 3 Levels of IL-17A and NF-κB p65 in the cerebral cortex in control group, sham operation group and TBI sub-groups

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与sham+NS组比较，a P < 0.01；与TBI+NS组比较，b P < 0.01；与sham+Y320组比较，c P < 0.01 图 4 不同时间点IL-17A和NF-κB p65的表达趋势图 Figure 4 The expression trend of IL-17A and NF-κB p65 at different time points

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与sham+NS组相比，TBI+NS组脑组织中NF-κB p65的表达水平明显升高，差异具有统计学意义(P < 0.01)。TBI+Y320组较TBI+NS组脑组织中NF-κB p65的表达水平明显下降，差异具有统计学意义(P < 0.05)。TBI+Y320组与sham+Y320组相比差异无统计学意义(P > 0.05)。4组之间差异具有统计学意义(P=0.007)。(见图 5)

A: sham+NS组、sham+Y320组、TBI+NS组及TBI+Y320组脑组织中NF-κBp65蛋白表达图谱；B: sham+NS组、sham+Y320组、TBI+NS组及TBI+Y320组脑组织中NF-κBp65灰度值(x±s)。与sham+NS组比较，a P < 0.01；与TBI+NS组比较，bP < 0.05 图 5 腹腔注射Y320后大鼠损伤区周围大脑皮质NF-κB p65的表达 Figure 5 Level of NF-κB p65 in the cerebral cortex after intraperitoneal injection of Y320

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多种因素参与了TBI后的继发性脑损伤，其中炎性介质和细胞因子发挥了重要作用^[11-12]，并在一定程度上决定创伤预后^[13-14]。IL-17A是新近发现的可由Th17、γδT、NKT等多种细胞分泌的促炎细胞因子，可与多种细胞因子协同放大炎症反应，在许多疾病发展中起重要作用^[15-16]，而在TBI中的作用研究甚少。

本研究中，TBI后脑组织中IL-17A的表达在12 h时开始升高并于3d时达到高峰，在第7天时则开始降低。对于IL-17A在TBI后表达升高的原因，目前尚未完全明确。可能与TBI后脑组织中的胶质细胞活化释放各类细胞因子有关，也可能与TBI后血脑屏障受损，外周免疫细胞透过血脑屏障聚集于中枢神经系统(central nervous system, CNS)并释放各类细胞因子释放有关^[17-18]。据报道，TBI后早期急性炎症反应及后期慢性炎症中IL-17A的表达可能来源于大脑固有免疫细胞^[19]。Lvy等^[20-21]在脑缺血-再灌注损伤模型中发现，小胶质细胞可通过分泌IL-17促进炎症反应，据此推测小胶质细胞可能是CNS中IL-17A的来源之一。在CNS中IL-17可与小胶质细胞上的受体结合，进而激活小胶质细胞，促进炎症反应，导致神经元坏死^[22]。

IL-17主要通过活化促分裂素原活化蛋白激酶(MAPΚ)和NF-κB两条信号通路发挥其生物学活性^[23]。其中NF-κB的激活是机体效应细胞大量释放促炎细胞因子，导致组织发生过度炎症反应和组织损伤的关键环节^[24-25]。NF-κB主要由p65和p50两亚基以二聚体形式组成，仅p65含有激活转录的处理区。在CNS中，NF-κB可广泛表达于神经元、星形胶质、小胶质和少突胶质等多种细胞内。但目前关于TBI中IL-17A信号传递的确切机制仍未完全明确。

本研究中，TBI后脑组织中NF-κB p65的表达明显升高，在TBI后3 d表达达到高峰，同时，NF-κB p65与IL-17A的动态变化趋势基本一致。另外，行为学研究发现，BBT评分峰值也在TBI后3 d，与前两者的表达高峰期具有时间上的一致性，提示两者在TBI后神经运动功能缺陷的发生发展中起重要作用。文献报道，IL-17A通过激活NF-κB，促进基质金属蛋白酶(MMPs)的表达，破坏血脑屏障的完整性，参与血管性脑水肿的形成^[26-27]。激活的NF-κB可诱导神经细胞产生如COX-2、P53、Fas配体等促凋亡因子，经过级联反应，最后激活蛋白酶Caspase导致神经元凋亡^[28]。据此推测，TBI后IL-17A通过激活NF-κB，参与了TBI后的继发性脑损伤过程，IL-17A可能是调控TBI后炎症反应的关键因子。

Y320是一种免疫调节剂，可抑制IL-17A的产生^[29]。本实验中，Y320可有效改善TBI后大鼠的学习认知能力，并使TBI后脑组织中NF-κB p65的表达水平明显下调。进一步提示脑损伤后IL-17A通过激活NF-κB，参与了TBI后的继发性脑损伤过程，通过调控IL-17A的分泌达到减轻炎症反应，从而改善TBI预后。但本研究中Y320未明显改善TBI后神经运动功能损伤，可能与本实验仅单次给药，而IL-17A在TBI后是持续参与炎症反应有关。尽管如此，笔者仍认为IL-17A参与TBI的机制可能成为TBI治疗的一个新的途径。总之，本研究表明，IL-17A参与了TBI后继发性脑损伤过程，并与炎症反应有关。进一步针对IL-17A的来源及作用机制将为TBI的临床治疗提供新的思路。