211166 南京,南京医科大学公共卫生学院卫生毒理系,现代毒理学教育部重点实验室(钱文溢、王军、肖杭)
Key Lab of Modern Toxicology (NJMU), Ministry of Education Department of Toxicology, School of Public Health, Nanjing Medical University, Nanjing 211166,China (Qian WY, Wang J, Xiao H)
2011年中国禁毒报告显示,全国登记在册的吸毒人员达154.9万,新滋生吸毒人员达21.4万人,其中大多数低于25岁[1],而潜在的吸毒人数甚至可能达到1 000~1 200万[2]。相较于传统鸦片、海洛因等毒品而言,近几年来,以甲基苯丙胺(METH,俗称“冰毒”)最具代表性的新型毒品在包括我国在内的全世界范围内迅速蔓延。METH滥用可导致严重的中毒现象,引起致命性并发症,常见有肝细胞坏死、心肌梗死、脑水肿、脑卒中、急性肾衰竭等[3]。有资料显示,美国每年因吸食METH而急诊就诊的人次高达94 000人次[4]。随着我国METH滥用人数及范围的不断蔓延,可以预见,METH滥用引起的中毒甚至多器官功能损伤在急危重症中的比例将逐渐增加。脑作为METH主要作用靶器官,其致死、致残作用逐渐被关注。因而,该研究主要围绕METH的神经毒性作用,探索METH急性暴露后小鼠行为学,脑皮层神经元分子生物学的改变,进而阐述METH引起神经元损伤的部分机制。
1 材料与方法 1.1 主要试剂Neurobasal medium,B27 (Gibco,美国),RIPA蛋白裂解液,cocktail蛋白酶抑制剂,Anti-β-actin(Sigma Aldich,美国), BCA蛋白定量试剂盒(Thermo Scientific,美国)Anti-Caspase3,Anti-Bcl2,Anti-Bax,Anti-Erk1/2,Anti-Erk1/2 Phospho(Thr202/Tyr204),Anti-JNK,Anti-JNK Phospho(Thr183/Tyr185),Anti-p38 MAPK,Anti-p38 MAPK Phospho(Thr180/Tyr182),山羊抗小鼠二抗,山羊抗兔二抗(Jacksonimmuno,美国),抑制剂PD98059,SP600125,SB203580(Cell Signaling Technology,美国),甲基苯丙胺(中国食品药品检定研究院),一氧化氮合酶活性检测试剂盒,线粒体膜电位(JC-1)测试盒。
1.2 实验动物分组C57BL/6J雄性小鼠随机(随机数字法)分为对照组、生理盐水组及METH组,每组10只。对照组不做任何处理,生理盐水组和METH组腹腔注射分别给予生理盐水和10 mg/kg的METH,每日2次(9:00,21:00),观察METH作用后小鼠行为学改变及对神经元的损伤作用。
1.3 小鼠刻板行为评分每次给药后,根据Sams-Dodd[5]和Hoffman[6]的方法,对小鼠刻板行为进行评分。评分标准:0分:静止不动或几乎没有活动;1分:正常活动,偶尔有向前运动;2~3分:活动伴随反复向前探索;4~5分:重复抬头、摇头、旋转或做摇头的背腹运动。以评分≥2 及刻板行为持续时间 ≥ 15 min 为合格模型。
1.4 小鼠Y迷宫实验最后一次METH给药后12 h,进行Y迷宫实验,实验步骤如下:训练期,挡板隔离新异臂(novel arm,NA)后,将小鼠放入起始臂(start arm,SA),使其在起始臂,其他臂(other arm,OA)自由穿梭10 min;间隔4 h后进行测试。测试时,挡板撤离NA后,将小鼠放入SA,使其在SA,OA,NA自由穿梭5 min,记录在各臂所在时间,及穿梭次数。
1.5 皮层神经元原代培养孕18天SD大鼠,七氟烷麻醉后断头处死,取胎鼠,分离左右大脑半球皮质,置于含HBSS缓冲液中,利用2.5 %的蛋白胰酶37 ℃消化,终止消化后依次经100 μm和40 μm细胞网筛过滤,过滤液150×g,离心10 min,加入5 mL神经元培养液,吹打成细胞悬浊液,以2×106/mL的细胞密度进行接种,每3 d进行半量换液,第8~10天获得成熟神经元可进行相应实验。
1.6 凋亡蛋白及MAPKs通路的检测组织或细胞用RIPA裂解,获取蛋白,将分离得到的总蛋白采用BCA法检测蛋白浓度,每个泳道加入40 μg蛋白进行电泳。以PVDF膜转膜,封闭后,一抗和二抗进行孵育,通过ECL发光液显色,置于Bio-rad凝胶成像系统成像收集条带信息;后经Image J软件进行灰度扫描分析,用目的条带与β-actin的吸光度比值来衡量表达情况,磷酸化蛋白水平表达则以目的条带与总的信号蛋白吸光度比值来衡量表达,实验重复三次。
1.7 彗星实验载玻片铺0.8%常温熔点琼脂糖凝胶,4 ℃凝胶,取0.8%低熔点琼脂糖凝胶与细胞悬浊液(104个)混匀,铺到晾干的载玻片上,贴上盖玻片,4 ℃凝胶,将载玻片放入盛有裂解液的染缸中,4 ℃裂解细胞4 h,清洗,电泳,滴加Tris-HCl中和液,晾干。滴加EB染色液染色,荧光显微镜下拍片,CASP软件分析。
1.8 线粒体膜电位检测按照试剂盒说明书进行,主要如下:在原代培养的皮层神经元细胞培养液中加入1 mL JC-1染色工作液,充分混匀,37 ℃细胞培养箱孵育20 min;配制适量的JC-1染色缓冲,冰浴备用;孵育结束后,吸除上清液,用JC-1染色缓冲液(1X)洗涤2次;加入2 mL细胞培养液,于高内涵细胞成像分析系统下观察。
1.9 统计学方法所有数据以均数±标准差(x±s)表示,利用SPSS 17.0 软件进行统计学分析,Graphpad Prism 5软件进行作图。多组定量资料比较采用单因素方差分析检验,多组间两两比较采用LSD-t检验或Dunnet t3检验,以P<0.05差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 小鼠METH作用后一般行为学变化METH组小鼠刻板行为评分和刻板行为持续时间显著高于对照组和正常小鼠组,差异具有统计学意义(P<0.01),对照组动物仅见注射后一过性的应激性行为改变。见表 1和图 1。
组别 | Day 1 | Day 2 | Day 3 | Day 4 | Day 5 | Day 6 | Day 7 |
对照组 | 0.4±0.5 | 0.4±0.5 | 0.4±0.5 | 0.6±0.5 | 0.5±0.5 | 0.7±0.4 | 0.7±0.4 |
生理盐水组 | 0.6±0.5 | 0.5±0.5 | 0.5±0.5 | 0.6±0.5 | 0.7±0.4 | 0.8±0.4 | 0.7±0.4 |
METH组 | 3.5±0.5a | 3.8±0.6a | 3.7±0.6a | 4.0±0.4a | 3.7±0.7a | 3.8±0.7a | 4.5±0.6a |
注:与生理盐水组比较,aP<0.01 |
在最后一次给予METH 12 h后,通过Y迷宫观察小鼠识别记忆能力的损伤情况。结果发现,小鼠在新异臂停留时间较其他几个臂稍高,但差异无统计学意义(P>0.05)(图 2A)。METH组小鼠在各个臂的穿梭次数显著低于对照组和生理盐水组,差异有统计学意义(P<0.05)(图 2B),说明METH影响小鼠活动量,其空间识别能力受损,探索能力降低,对新环境探索行为受抑制。
2.3 METH显著提高皮层组织iNOS活性利用NOS活性测定试剂盒检测METH处理后,小鼠脑皮层组织TNOS及iNOS活性(图 3A)。与对照组比较,METH组脑皮层组织匀浆中TNOS(2.53±0.52)U/mg prot,活性上升,差异具有统计学意义(P<0.05)。进一步分析iNOS的活性,结果发现METH处理组小鼠脑皮层组织匀浆液中iNOS的活性水平(2.16±0.11)U/mg prot显著高于对照组(0.84±0.26)U/mg prot,差异具有统计学意义(P<0.01)(图 3B)。
2.4 METH对小鼠皮层组织凋亡蛋白表达的影响为进一步观察METH对小鼠脑组织的损伤作用。利用Western blot法,检测凋亡标志性蛋白Bax、Bcl2、Caspase3表达水平。结果发现,METH暴露显著增加皮层脑组织Bax蛋白的表达,并激活下游凋亡联级反应,表现为Caspase 3水解,其激活形式17 000的cleaved Caspase 3 (c-caspase 3)表达显著增高。而抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平与对照组及生理盐水组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。
2.5 METH暴露对原代培养神经元DNA的损伤作用在动物实验的基础上,进一步在细胞层面上观察了不同浓度及给予METH不同时间后,神经元DNA的损伤作用。通过彗星实验,发现METH可明显引起细胞的拖尾现象(图 5),对照组发生拖尾现象的细胞仅为(1.24±0.69)%,300 μmol/L METH孵育24 h后,拖尾发生率达(17.74±1.60)%,96 h后,这一发生率达到(52.31±5.08)% ,同样随着时间的延长,尾部DNA,尾长及Olive 尾矩亦表现为增加或增长,具有时间依赖性(表 2)。 此外,利用不同浓度的METH分别与神经元细胞进行孵育,发现随METH浓度的增大,细胞拖尾率,尾部DNA含量,拖尾长度及Olive 尾矩显著增多或变长,具有剂量依赖性(表 3)。
(METH) (h) | 拖尾发生率 (%) | 尾部DNA (%) | 尾长 (μm) | Olive 尾矩 (μm) |
0 | 1.24±0.69 | 0.59±0.19 | 0.47±0.21 | 0.41±0.23 |
12 | 2.25±1.06 | 14.31±5.67a | 29.46±5.22a | 4.89±2.43a |
24 | 17.74±1.60a | 16.52±6.46a | 30.14±4.99a | 6.25±2.18a |
48 | 24.97±2.45a | 18.72±3.80a | 31.22±3.01a | 6.87±1.52a |
72 | 34.22±3.15a | 22.50±2.64a | 36.25±2.68a | 8.05±1.37a |
96 | 52.31±5.08a | 26.75±2.57a | 41.75±2.77a | 9.84±2.05a |
注:与对照组比较,aP<0.01 |
(METH) (μmol/L) | 拖尾发生率 (%) | 尾部DNA (%) | 尾长 (μm) | Olive 尾矩 (μm) |
0 | 1.24±0.69 | 0.59±0.19 | 0.47±0.21 | 0.41±0.23 |
100 | 8.94±3.86a | 9.39±3.27a | 16.28±3.71a | 4.67±1.44a |
300 | 24.97±2.45a | 18.72±3.80a | 31.22±3.01a | 6.87±1.52a |
1 000 | 49.31±6.08a | 30.90±4.37a | 38.46±43.20a | 9.27±2.81a |
注:与对照组比较,aP<0.01 |
将细胞与线粒体探针JC-1孵育,同时以羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)为阳性对照(一种质子载体,可破坏线粒体内膜质子梯度,破坏线粒体膜电位,引起细胞凋亡)在高内涵细胞成像分析系统下动态观察300 μmol/L 的METH对神经元线粒体膜的影响。结果显示,随METH加入细胞时间增加,聚集在线粒体基质的JC-1呈红色荧光的多聚体 (J-aggregates)减少,红色荧光降低;JC-1单体(monomer)增多,绿色荧光增强,提示线粒体膜电位反转,膜通透性发生改变。而CCCP作为阳性对照,其作用后神经元线粒体在30 min内膜电位迅速下降,见图 6。
2.7 METH对MAPKs通路的激活及MAPKs通路在METH引起神经元损伤中的作用MAPKs (ERK1/2,JNK,p38 MAPK)通路对于细胞的生存或凋亡作用关键,因而观察了METH对MAPKs的影响。将原代神经元与300 μmol/L METH孵育,发现METH能显著激活MAPKs通路,其中ERK1/2通路在0.25 h和0.5 h即被显著激活,而JNK通路在2 h和4 h被激活,其磷酸化水平显著上升,对于p38 MAPK通路,在0.5、1、2 h时间点显著激活,磷酸化水平增加。对于总的ERK1/2,JNK及p38 MAPK的表达,其蛋白条带未发生明显改变,与0 h比较,差异无统计学意义(P>0.05),见图 7。
为进一步探讨MAPKs在METH引起神经元损伤中的可能作用,分别将神经元细胞与ERK1/2,JNK,p38 MAPK抑制剂PD98059 (10 μmol/L),SP600125 (10 μmol/L),SB203580 (10 μmol/L)预孵育1 h,后用METH处理细胞48 h,观察凋亡蛋白c-caspase 3的表达。如图 8所示,300 μmol/L METH可显著增加cleaved caspase 3的17 000及19 000两个水解蛋白的表达,而SB203580预先处理后,cleaved caspase 3的17 000及19 000蛋白片段明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。此外,PD98059 (10 μmol/L),SP600125 (10 μmol/L)预处理亦有降低cleaved caspase 3的17 kD及19 kD蛋白表达的趋势,但与对照组比较,差异无统计学意义。
3 讨论以甲基苯丙胺为代表的新型毒品在全世界范围内迅速蔓延。据2007年联合国犯罪与毒品办公署的一份报告显示,全球范围内,甲基苯丙胺的吸食者达1 600万,而2013年一项数据统计中,这一人群已高达5 200万[7]。在急诊救治的患者中,METH中毒所导致的机体损伤已不再罕见[8]。脑作为METH作用的靶器官,其在METH引起的损伤中越来越受到人们关注。METH引起脑部损伤涉及多种机制,如氧化应激,兴奋性毒性,炎性反应,高热反应等,而这些毒性机制的研究大多仅局限于单胺神经元的损伤,而对非单胺神经元损伤的研究较少[9]。研究显示,海马,前额片区的神经元对METH的毒性同样敏感,大量METH吸食后,可导致这些区域神经元的凋亡[10]。
本研究通过多种实验方法,发现在行为学上,给予METH后,小鼠数天内表现为刻板行为的增加,表现为无明显目的的、不变的、以固定频率反复重复的无任何功能效果的简单行为。另外,小鼠探索和识别空间的记忆能力显著下降,这可能与METH暴露引起小鼠神经元的损伤相关。神经元损伤过程中NO的大量产生可导致神经毒性,且与iNOS激活有关[11]。本研究结果发现,METH作用后,iNOS活性显著升高,而大量增多的NO可抑制线粒体呼吸功能和糖酵解、造成能量代谢障碍,抑制DNA合成、损害DNA结构[12]。通过JC-1探针法,发现METH处理细胞后,短时间内线粒体膜电位即发生下降,使膜通透性转运孔道异常开放。而线粒体功能异常与能量代谢障碍、钙稳态失调和活性氧的产生相关[13]。 因而,在蛋白水平,观察到了相应的现象,即METH作用后,位于线粒体膜上的凋亡蛋白Bax水平显著上调,继而通过线粒体途径激活下游caspase 3凋亡途径,导致神经元损伤。此外,在细胞水平,METH处理后,DNA片段断裂或降解,呈浓度和时间依赖性介导细胞死亡,表现为明显的拖尾现象。
笔者前期工作表明,MAPKs通路作为重要的信号转导途径在介导细胞凋亡的过程中扮演重要角色[14]。本研究中,METH作用于神经元细胞后,MAPKs通路显著被激活,ERK1/2,JNK和p38 MAPK磷酸化水平上调,且在MAPKs中只有p38 MAPK抑制剂能部分逆转由METH引起的神经元损伤,这可能与p38 MAPK特异性调节某些与凋亡密切相关的离子通道如外向整流钾通道Kv2.1相关[15]。
本研究针对目前日益增多的METH滥用所引起的中枢神经损伤,从多角度阐述了METH滥用及中毒所导致的脑损伤,因而在METH滥用引起的中毒及其脑损伤的治疗能提供部分参考作用,具有一定的临床意义。
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