2016, Vol. 25
80045 美国 奥罗拉，科罗拉多大学安舒茨医学院临床医学系(David A. Schwartz)
Department of Medicine, University of Colorado Denver-Anschutz Medical Center, Aurora 80045, US (David A. Schwartz)
百草枯(paraquat，PQ，C12H14Cl2N2)作为一种世界范围内被广泛使用的除草剂，其造成的急性中毒仍然位列我国中毒领域死因的流行病学之首[1-2]，成为严重公共卫生问题。尽管临床上绝大多数的中毒发生于百草枯经消化道产生全身吸收，但其特征性的肺内浓聚现象使得肺脏成为百草枯中毒最易受累器官，产生急性肺损伤和快速纤维化异常修复，造成呼吸衰竭是百草枯致死的最主要病因[3-4]。
目前已知百草枯中毒的临床治疗效果，尤其是针对中重度中毒患者的救治仍然不佳，病死率居高不下。为了能够更准确地研究百草枯中毒所致肺部疾病，获得可控的同质性较好的数据，动物模型是研究百草枯中毒相对理想的手段和方法之一[5-6]。1974年即有学者根据百草枯在不同种属肺内分布的动力学常数观察发现，大、小鼠与人的相关常数值非常接近[7]，故大、小鼠是研究百草枯在肺内蓄积、损害的理想模型。
尽管追溯国内外文献，不乏针对百草枯肺损伤和/或肺纤维化动物模型的研究报道[8-10]，但在给药途径、给药剂量、以及给药时间等研究细节尚未统一，研究结果的可重复性仍存在一定争议。因此仍有必要进一步探讨和优化百草枯相关动物疾病模型。本文通过观察不同时段、剂量腹腔注射百草枯对于小鼠肺损伤及肺纤维化诱导效果的区别，以期建立更为合适、操作简便且结果稳定的肺损伤和/或肺纤维化动物模型。
1 材料与方法 1.1 材料雄性C57BL/6J小鼠，8~10周龄，20~26 g，购于Jackson实验室(Bar Harbor,ME)；实验地点为美国科罗拉多大学安舒茨医学院实验动物中心，以及南京医科大学实验动物中心。百草枯粉剂购于Sigma公司(St. Louis，MO，USA)。溶于0.9%生理盐水配置三种终浓度为1.0 mg/mL；2.5 mg/mL；5.0 mg/mL，分装并放置-20 ℃冻存。每管分装液仅使用一次。本试验获得南京医科大学动物伦理批准(伦理编号：IACUC-14030122)；美国科罗拉多大学动物伦理批准(伦理COMIRB号：14-0480)。
1.2 方法 1.2.1 实验分组C57BL/6J小鼠随机(随机数字分组)分为单次给药、连续给药、间断给药组内的不同浓度百草枯处理组(PQ组各浓度、各时间点小鼠7~10只)；每组各收获时间点分别匹配随机分组的生理盐水对照组(对照组各浓度、时间点小鼠9~10只)。
1.2.2 动物模型方法建立小鼠在恒温恒湿动物中心的鼠笼饲养，昼夜交替进行，垫料、食物由专职技术员处理补给，水源由中央供水系统提供。实验前均给予环境适应性饲养1周。所有给药时间点均为当日上午8：30-9：30完成。于末次给药后的1周、2周处死小鼠并收获标本。单次给药组：一次性经腹腔注射百草枯(D0)，剂量分别为40 mg/kg、50 mg/kg、或60 mg/kg。生理盐水对照组给予一次性经腹腔注射0.9%生理盐水200 μL/只； 连续给药组：连续每天腹腔注射PQ，共5天(D0~D4)。剂量分别为10 mg/kg、12.5 mg/kg或15 mg/kg。生理盐水对照组给予连续5 d经腹腔注射0.9%生理盐水200 μL/只；间断给药组：腹腔注射PQ，每4天一次，共4次(D0，D4，D8，D12)。剂量分别为20 mg/kg、22.5 mg/kg或25 mg/kg。生理盐水对照组同期给予经腹腔注射0.9%生理盐水200 μL/只。
1.2.3 小鼠一般情况监测每日测量每只小鼠的体质量，记录体质量变化，并观察小鼠活动状态、毛色、活动度、呼吸情况等变化。若有小鼠死亡，记录死亡日期。
1.2.4 肺功能结果测定通过麻醉后气管切开，小鼠气道留置导管并连接FlexiVent(SCIREQ，USA)动物肺功能仪，排尽肺内气体状态下监测压力-容积曲线获得肺静态顺应性结果。
1.2.5 肺泡支气管灌洗(BAL)打开胸腔暴露双侧肺部，短暂夹闭左侧主支气管，单侧右肺进行3×0.5 mL肺泡支气管灌洗(BAL)，灌洗液配置成份：50 mL PBS+5 mmol/L EDTA。灌洗液经红细胞裂解液(Sigma，USA)处理后通过Cytospin(Thermo，USA)细胞离心涂片，瑞士-吉姆萨改良染色法染色，行细胞总数及分类计数。
1.2.6 羟脯氨酸浓度测定总胶原浓度定量通过右肺匀浆测量羟脯氨酸浓度获得：取200 μL右肺匀浆组织，同体积12当量盐酸100 ℃过夜消化，经柠檬酸盐缓冲液氧化及氯胺T水溶液重结晶，对二甲氨基苯甲醛试剂65 ℃孵育后，采用酶标仪(BioTek Instruments Inc.,USA)550 nm处比色。根据吸光值绘制标准曲线及测定样本值。
1.2.7 肺部组织病理学观察10%甲醛灌注后固定小鼠左肺24 h，沿横截面将肺叶切成6~8片，每片厚度1.5 mm。石蜡包埋切片后分别进行HE染色、天狼星红特异性染色来评估胶原纤维的沉积，偏振光下观察胶原纤维分布位置。采用3DHISTECH数字切片扫描系统(Budapest，Hungary)全片扫描后随机化取图并采用改良Ashcroft评分法[11]进行半定量评估。
1.3 统计学方法所有数据收集后以均数±标准差(x±s)表示，SPSS 17.0软件进行统计学分析、Graphpad Prism 5软件进行统计学分析及
2 结果 2.1 一般情况各组内对照小鼠体质量逐渐增加，活动度佳，毛发光泽，呼吸未见异常；单次给药以及间断给药组造模小鼠，部分出现体质量下降、懒动、呼吸急促，毛色不光泽等表现；各组死亡小鼠体质量均明显下降(数据未显示)；重复给药组的造模鼠未出现以上表现。图 1示各组内两个观察点存活小鼠的体质量变化。可见除重复给药组以外，各组造模小鼠在接受PQ腹腔注射后第一个24 h即有明显体质量下降，末次给药后4~7 d为体质量下降最明显阶段，随后体质量有逐渐回升趋势。
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| A：单次给药组；B：重复给药组；C：间断给药组 图 1 PQ对小鼠体质量变化的影响 Figure 1 Effects of PQ on body weight change in mice |
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图 2结果显示各组对照无死亡；重复给药组在各观察点存活率均超过80%；各组造模小鼠死亡时间主要集中在末次给药后4~7 d；间断给药组存活率略优于单次给药组；同组间剂量越高，存活率越低，60 mg/kg剂量组总存活率低于30%，25 mg/kg剂量组总存活率也仅45%。
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| A：单次给药组(1周收获)；B：单次给药组(2周收获)；C：重复给药组(1周收获)；D：重复给药组(2周收获)；E：间隔给药组(1周收获)；F：间断给药组(2周收获);与对照组比较，aP<0.01 图 2 PQ对小鼠生存率的影响 Figure 2 Effects of PQ on survival rate in mice |
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如图 3所示，分别与组内对照比较，1周观察点单次给药组与间断给药组的造模小鼠在静态顺应性上均有下降趋势，但仅40 mg/kg剂量组差异存在统计学意义(P<0.01)；2周观察点各组内造模小鼠与对照比较差异均无统计学意义，且高剂量组的静态顺应性结果较对照有升高趋势；重复给药组内各观察点的肺静态顺应性结果差异趋势不明显。
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| A：单次给药组；B：重复给药组；C：间断给药组;与对照组比较，aP<0.01 图 3 PQ对小鼠肺功能的影响 Figure 3 Effects of PQ on lung function in mice |
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镜下观察BALF涂片(图 4)，1周观察点单次给药组和间断给药组的造模鼠BALF细胞总数均明显升高，中性粒细胞和淋巴细胞的比例也升高，与组内对照差异均有统计学意义，且剂量越高，差异越显著；2周观察点以上两组造模鼠的细胞总数均明显下降，中性比例回退。但高剂量组细胞总数和淋巴细胞比例与组内对照比较仍然有统计学差异；重复给药组各观察点的BALF细胞计数及细胞分类未见明显变化。图 5为以单次给药组60 mg/kg剂量为例，不同时间点BALF的代表图，可见1周时中心粒细胞浸润和2周的淋巴细胞增多。
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| A：单次给药组；B：重复给药组；C：间断给药组;与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01 图 4 PQ对小鼠支气管肺泡灌洗液中细胞分类的影响 Figure 4 Effects of PQ on BALF cytospin in mice |
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| A：生理盐水对照；B：给药后7 d的60 mg/kg剂量组；C：给药后14 d的60 mg/kg剂量组;红色箭头指向中性粒细胞；黑色箭头指向小淋巴细胞 图 5 不同时间点支气管肺泡灌洗液细胞离心涂片代表图 Figure 5 Representative of the BALF neutrophils and lymphocytes in different intervals |
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单次给药组和间断给药组在两个观察点的造模鼠较对照均有升高趋势，且2周观察点浓度略高于1周观察点，但各组差异均无统计学意义；重复给药组在两个观察点的羟脯氨酸浓度与同组对照比较差异无统计学意义(图 6)。
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| A：单次给药组；B：重复给药组；C：间断给药组 图 6 PQ对小鼠右肺羟脯氨酸浓度的影响 Figure 6 Effects of PQ on hydroxyproline level of right lung in mice |
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图 7为全片扫描后(放大倍数×40)各组小鼠完整左肺天狼星红染色代表图，可见1周观察点单次给药组和间断给药组的小鼠肺叶已出现损伤，剂量越高，损伤累积范围越重，损伤区域以胸膜下、外周、背后段(小鼠左肺为单一叶)为主；2周时已有损伤区域的纤维化程度加重；重复给药组在各观察点肺叶损伤均不明显。
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| A：单次给药组；B：重复给药组；C：间断给药组 图 7 各组小鼠左肺病理全片扫描代表图(×40) Figure 7 Representative of whole scan left lung histology of paraquat- and saline-treated mice(×40) |
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局部放大(放大倍数×200)见正常小鼠(图 8)肺组织气道及肺泡结构清晰完整，胶原纤维主要分布在气道及伴行的血管周围。与各组对照(数据未显示)比较，1周观察点单次给药组和间断给药组的HE染色示炎症细胞浸润肺泡内及肺泡间，肺泡间隔增厚、结构破坏伴出血水肿，偏振光下已出现胶原纤维的异常增生；2周观察点在前面损伤部位胶原纤维和成纤维细胞明显沉积，肺泡结构破坏进一步加重；而间断给药组在1周见少量炎性细胞，肺泡结构完整，2周仅15 mg/kg剂量组有一只发生胸膜下胶原纤维增生(图 9)。
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| A：H & E染色；B：天狼星红染色(明场)；C：天狼星红染色偏振光视野 图 8 正常小鼠(生理盐水组)左肺病理图片(×200) Figure 8 Histology of left lung of saline-treated mice(×200) |
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| A：单次给药组(1周收获)；B：单次给药组(2周收获)；C：重复给药组(1周收获)；D：重复给药组(2周收获)；E：间断给药组(1周收获)；F：间断给药组(2周收获) 图 9 各PQ处理组左肺病理代表图(×200) Figure 9 Representative of left lung histology of PQ-treated mice(×200) |
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两个时间点采用改良Ashcroft评分法进行纤维化半定量评估(图 10)，1周时单次给药组的60 mg/kg剂量(P<0.01)和间断给药组的25 mg/kg剂量(P<0.05)与对照比较差异有统计学意义。2周时仅60 mg/kg组与对照比较差异有统计学意义(P<0.05)。
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| A：1周收获各组；B：2周收获各组;与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01 图 10 各组病理学改良Ashcroft评分 Figure 10 The Modified Ashcroft Scale of Pathological grade in each group |
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本研究通过观察不同时段剂量的百草枯腹腔注射诱导C57BL/6J小鼠发生急性肺损伤和/或肺纤维化，并进行效果评价。结果发现单次或间断腹腔注射不同剂量PQ，均可诱导部分小鼠发生急性肺损伤，表现为早期观察时间点存活小鼠体质量下降；肺功能静态顺应性降低；BALF涂片细胞增多且中性粒细胞比例升高；肺组织病理切片HE染色见大量炎症细胞浸润及水肿。晚期观察点少量存活小鼠可发生肺间质纤维化，表现为BALF涂片中性粒细胞比例减少、淋巴细胞比例较前升高；羟脯氨酸浓度升高；病理天狼星红染色可见胶原纤维在胸膜下、外周以及接近背段的间质沉积。
早在1984年百草枯论著Biochemical Mechanisms of Paraquat Toxicity一书中就有学者指出大鼠单次腹腔注射一定剂量的百草枯，诱导肺纤维化的发生率仅10%~20%[12]。若给药剂量一旦超过LD50，4 d内病死率接近80%。本研究表明,单次大剂量或间断中等剂量腹腔注射作为PQ全身性给药的方法之一，可以成功诱导出小鼠急性肺损伤，但由于能够有效诱导出急性肺损伤 的给药方式，其早期的病死率也明显升高，使得成功过度早期炎症损伤，到中晚期形成纤维化的小鼠数量不足，影响了晚期肺纤维化的发生率。这也证实了前期学者的观点：肺纤维化的致病率由于动物早期的大量死亡而明显降低。
本研究中的另一组给药方式——小剂量连续给药法并不能明显诱导出C57BL/6J鼠系的肺损伤及肺纤维化。考虑百草枯对于小鼠的毒性效应不仅取决于总剂量，而且与每次给药剂量以及给药间隔均相关。小鼠有其自身特点，虽然肺部快速蓄积百草枯，但强大的自愈能力可以快速清除小剂量百草枯造成的局部损伤，早期不残留炎症损伤，晚期亦无明显的纤维化异常修复[13]。而另一方面，本课题组在前期的研究中[14]，通过BALB/c小鼠连续5 d腹腔注射10 mg/kg的百草枯，不仅引起了较高的病死率(60%)，且在第12天的存活小鼠中成功诱导出肺纤维化。因此考虑本次结果与不同鼠系的体质、对PQ的敏感性、以及自愈和炎症清除能力均有一定关系。
腹腔注射法作为简便易行的全身性给药方式之一，仍然有其自身的特点和优势：一定剂量和时段的百草枯通过腹腔注射的方式，可以成功诱导小鼠出现急性肺损伤，这与临床上中毒患者的症状和体征相符[15]；腹腔注射法造成的肺损伤和纤维化的分布区域主要在胸膜下、接近外周和背段,与临床上人类百草枯致肺部病损位置相近[16]；左侧的病理学半定量结果与右侧肺叶的羟脯氨酸定量结果大致接近，提示腹腔注射造成的病变在双肺分布较均匀。因此考虑腹腔注射百草枯诱导小鼠早期肺损伤，将收获时间提前，可以作为有效的模式动物，为人类相关疾病提供研究对象。
本次研究的肺功能结果中观察到2周时间点高剂量组的静态顺应性结果较对照有升高趋势，根据羟脯氨酸定量以及病理结果提示，2周观察点，高剂量组的小鼠肺组织较1周应该发生明显纤维化增生。理论上，纤维化肺组织的静态顺应性较正常肺组织下降，但本研究观察结果与之相反，仔细检查小鼠肺组织病理图片，发现2周时高剂量组的肺组织结构破坏明显，部分出现空洞，以及类似“肺气肿”样结构改变，故考虑肺功能结果可能与结构改变有关。
单次大剂量或间断中等剂量腹腔注射作为PQ全身性给药的方法之一，可以成功诱导出早期小鼠急性肺损伤，但研究终点肺纤维化的致病率较低。因此今后通过百草枯干预致肺纤维化的动物模型还需要在方法学上进一步探讨和实践。
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