043300 河津,山西省河津市疾病预防控制中心(吴黎明)
Hejin Municipal Center for Disease Control and Prevention,Hejin 043300,China (Wu LM)
蘑菇中毒一般是误采误食毒蘑菇引起的,轻者影响身体健康,重者导致生命危险甚至于死亡[1]。蘑菇中毒多发生在夏秋阴雨季节,以家庭散发为主,在全国各地均有发生[2]。由于地理环境、气候条件和生活习惯不同,引起毒蘑菇中毒的蘑菇品种、中毒发生场所及病死率也存在很大的地域性差异。本文对2014年9月发生在山西省河津市的一起毒蘑菇中毒事件进行了调查,并结合此事件对蘑菇中毒患者诊断、事件病因确定等进行分析。
1 资料与方法 1.1 一般资料山西省河津市某小区居民共14人,男性7人,女性7人,年龄31~60岁,职业为农民和工人。
1.2 流行病学调查山西省河津市疾控中心对事件开展现场调查,包括现场采样,向中毒患者及家属了解可疑餐次、食品及发病情况;向临床救治医生了解中毒患者的主要临床表现、病程、诊断和治疗情况,摘录和复印相关病例资料。
1.3 毒物鉴定将收集到的剩余未食用毒蘑菇进行拍照并取20 g样品用硅胶进行干燥送至中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所进行鉴定,由于样本形态不完整,无法进行毒蘑菇的形态学鉴定,因此采用分子生物学鉴定。提取毒蘑菇样品DNA采用PCR技术进行ITS片断扩增并测序,然后进行系统发育学分析。
分子生物学鉴定利用The Phire Plant Direct PCR 试剂盒(Finnzymes Oy,Finland)进行PCR产物扩增。干燥的蘑菇用50 μL的稀释缓冲液裂解,室温孵育5 min,30 μL的反应体系中加入1 μL的的上清液作为扩增模板。采用的片段为ITS,扩增引物为ITS5 (GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G)和ITS4 (TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC)[3]。扩增反应程序:98 ℃预变性5 min;98 ℃变性5 s,58 ℃复性5 s,72 ℃延伸5 s,40个循环后72℃延伸10 min,4 ℃保温。取3 μL PCR产物点样并进行电泳,结束后在凝胶成像仪下拍照并记录结果。将电泳条带单一明亮、片段大小约650 bp的样品送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
将DNA序列用Clustal x 1.83进行比对,然后用BioEdit 7.0.5.3对序列进行手工校对[4-5]。系统发育树构建采用最大简约法,使用软件为PAUP* 4.0b10[6]。最大简约性分析法中,所有参与分析序列上的位点均作为等权处理,位点上的空格视为缺失。Max-trees设为5 000,其他参数采用默认值,采用启发式搜索进行1 000次自举分析[7]。
2 结果 2.1 流行病学调查 2.1.1 基本情况2014年9月26日19:00-21:00,山西省河津市某村村民宴请亲朋好友共14人,共同进食的食物为蘑菇炒肉(自采野生蘑菇)、炒茴子白、炒土豆丝、红薯、馒头、米粥。首发病例出现恶心、出汗、流涎、腹泻、乏力,随后14名进食者相继发病,罹患率为100%;潜伏期0.5~1.5 h,潜伏期中位数为1 h,高峰集中在20:00-21:00;14名患者中男女各7例;年龄31~60岁,年龄中位数为41.5岁;职业为农民和工人;均就诊于山西省河津市人民医院,27日4:00 8例症状严重的患者转至山西省运城市中心医院接受治疗,6例症状轻微的患者继续在河津市人民医院接受治疗。
2.1.2 临床表现及救治情况主要临床表现为恶心、呕吐、腹痛、腹泻、出汗、流涎、乏力,其中4人出现瞳孔缩小、视物模糊,体格检查未发现异常体征。实验室检查发现2人肝功能指标异常。初步诊断为食物中毒,给予洗胃、保肝、利尿和对症支持治疗。在运城市中心医院的8名患者治疗3 d后视力恢复正常,实验室检查未见异常,继续采取吸氧、保肝、利尿和对症支持疗法,并于9月30日痊愈出院;在河津市人民医院的6名患者治疗4 d后3名患者恢复正常,另3名患者病情平稳,肝肾功能异常(ALT最高达57 U/L;总胆红素最高达26.44 mmol/L;直接胆红素最高达30.60 mmol/L;血肌酐最高达105 μmol/L;血尿素氮最高达11.08 mmol/L),继续采取保肝、利尿和对症支持疗法,于10月4日全部痊愈出院。
2.2 毒蘑菇分子生物学鉴定应用ITS片段构建的墨汁鬼伞(coprinopsis atramentaria)的系统发育树:共28个单元。所有733个特征位点包括456个恒定特征,86个无简约信息可变特征,以及191个简约信息特征。简约法共得到1个MP树,系统发育树的TL为661,CI为0.582,RI为0.712,RC为0.415,HI为0.418。具体系统发育树拓扑结构图见表 1。
Taxa | Voucher | ITS |
Ingroup | ||
Coprinopsisacuminata | SZMC-NL-0958 | JX118698 |
Coprinopsisatramentaria | SZMC-NL-2148 | FM878014 |
Coprinopsisacuminata | SZMC-NL-3028 | HQ847046 |
Coprinopsisatramentaria | SZMC-NL-3399 | FN396110 |
Coprinopsisatramentaria | SZMC-NL-4245 | FN396123 |
Coprinopsisatramentaria | SX2014092607 | KR733589* |
Coprinopsisatramentaria | ubcf16572 | FJ627023 |
Coprinopsiscandidolanata | 794 | JF907837 |
Coprinopsiscinerea | SZMC-NL-1758 | JN943128 |
Coprinopsisechinospora | 582(CHU3019) | AB071803 |
Coprinopsisechinospora | CBM-FB21725 | AB071800 |
Coprinopsisechinospora | CBM-FB14562 | AB097561 |
Coprinopsisepiscopalis | SZMC-NL-3032 | FN396118 |
Coprinopsisfluvialis | SZMC-NL-0840 | HQ847011 |
Coprinopsisjonesii | SZMC-NL-0777 | FN396116 |
Coprinopsislagopus | SZMC-NL-2124 | JN943125 |
Coprinopsisneolagopus | NBRC100013 | AB097564 |
Coprinopsisnovorugosobispora | - | AB978534 |
Coprinopsisaff.phlyctidospora | 936NZ(CHU3009) | AB071790 |
Coprinopsisaff.phlyctidospora | No2.AU(CHU3026) | AB071796 |
Coprinopsisphlyctidospora | 15575 | JF907842 |
Coprinopsispicacea | SZMC-NL-0174 | FN396115 |
Coprinopsisradiata | SZMC-NL-1428 | JN943126 |
Coprinopsisrugosobispora | Schafer601 | HQ847050 |
Coprinopsisspilospora | 15273 | JF907840 |
Coprinopsisvermiculifer | CBS132.46 | GQ249279 |
Outgroup | ||
Parasolaauricoma | SZMC-NL-0087 | JN943107 |
Parasolamegasperma | SZMC:NL:1924 | FM163208 |
注:a 本实验产生的序列,其他序列来自 GenBank |
应用ITS片段构建的毛头鬼伞(coprinus comatus)的系统发育树:共11个单元。所有657个特征位点包括497个恒定特征,83个无简约信息可变特征,以及77个简约信息特征。简约法共得到1个MP树,系统发育树的TL为192,CI为0.964,RI为0.954,RC为0.919,HI为0.036。具体系统发育树拓扑结构图见表 2。
Taxa | Voucher | ITS |
Ingroup | ||
Coprinuscomatus | 1157 | JF907838 |
Coprinuscomatus | NW413 | EU520139 |
Coprinuscomatus | NW483 | EU520190 |
Coprinuscomatus | SMCC57.01.1 | FJ501551 |
Coprinuscomatus | SX2014092602 | KR733588a |
Coprinuscomatus(submittedasC.sterquilinus) | XSD-19 | EU326221 |
Coprinussterquilinus | 15595 | JF907843 |
Coprinussterquilinus | KACC49380 | AF345821 |
Coprinussterquilinus | - | U85335 |
Outgroup | ||
Cystolepiotabucknallii | 490 | JF907979 |
Melanophyllumhaematospermum | E.C.Vellinga2517 | AF391039 |
注:a 本实验产生的序列,其他序列来自 GenBank |
应用ITS片段构建的丝盖伞属(inocybe cf rimosa)的系统发育树:共17个单元。所有700个特征位点包括486个恒定特征,109个无简约信息可变特征,以及105个简约信息特征。简约法共得到1个MP树,系统发育树的TL为305,CI为0.869,RI为0.852,RC为0.740,HI为0.131。具体系统发育树拓扑结构图见表 3。
Taxa | Voucher | ITS |
Ingroup | ||
Inocybebulbosissima | EL6605 | AM882765 |
Inocybebulbosissima | EL37_06 | FJ904161 |
Inocybemelliolens | EL224_06 | FJ904149 |
Inocybemelliolens | PAM05052303 | FJ904148 |
Inocybecfmicrofastigiata | EL113_06 | FJ904156 |
Inocybeumbrinella | JV13699 | FJ904165 |
Inocybeumbrinella | JV17954 | FJ904166 |
Inocybeumbrinella | PC081010 | FJ904164 |
Inocybeumbrinella | PC080816 | FJ904163 |
Inocyberimosa | AO2008_0250 | FJ904147 |
Inocyberimosa | EL118_08 | FJ904146 |
Inocybesororia | JV15200 | FJ904151 |
Inocybesororia | Kuoljok0512 | FJ904150 |
Inocybecfrimosa | JV22619 | FJ904157 |
Inocybecfrimosa | SX2014092604 | KR733590a |
Inocybecfrimosa | TAA185135 | AM882766 |
Outgroup | ||
Inocybeobsoleta | EL1704 | AM882769 |
注:a 本实验产生的序列,其他序列来自 GenBank |
系统发育结果表明检测样本SX2014092607与墨汁鬼伞聚类到同一分枝,获得较高支持率(图 1,MP=91%);检测样本SX2014092602与毛头鬼伞聚类到同一分枝,获得较高支持率(图 2,MP=100%);检测样本SX2014092604与inocybe rimosa,inocybe bulbosissima,inocybe melliolens,inocybe cf microfastigiata,inocybe umbrinella和inocybe sororia聚类到一起,但未与目前已知的该类群某个种形成单系群(图 3)。
3 讨论我国的毒蘑菇及毒素种类繁多,目前包括怀疑有毒的种类多达421种,隶属于39科、112 属,已知的毒蘑菇毒素有30多种[1]。毒蘑菇以未知种类为主(77.09%),已知种类的毒蘑菇多仅能鉴定至科级,以鹅膏科和牛肝菌科毒蘑菇为主[8]。毒蘑菇毒素种类多且成分复杂,一种毒蘑菇可含多种毒素,一种毒素也可存在于多种毒蘑菇中。毒蘑菇中毒临床表现较为复杂,我国毒蘑菇中毒临床分型主要为以下六型:胃肠炎型、神经精神型、溶血型、肝脏损害型、呼吸循环衰竭型和光过敏性皮炎型[1]。目前我国尚无突发中毒毒蘑菇毒素的实验室检验标准,毒蘑菇中毒事件的诊断主要依据现场流行病学调查结果、患者临床表现和蘑菇形态学特征鉴定进行。
依据《食物中毒诊断标准及技术处理总则》的诊断标准,本次事件流行病学调查发现14名患者在同一地点进食了同一来源的原料(自采野生蘑菇)加工而成的食物,在大致相同的潜伏期内相继出现类似的临床症状,发病时主要表现为恶心、呕吐、腹痛、腹泻、出汗、流涎、乏力,其中4人出现瞳孔缩小、视物模糊,后续临床表现为肝功能和肾功能损伤,初步判定为一起误食毒蘑菇引起的食物中毒[9]。通过分子生物学鉴定发现毒蘑菇的种类为墨汁鬼伞、毛头鬼伞和丝盖伞属,最终确定此事件是一起多种毒蘑菇引起的复合毒蘑菇中毒事件。根据卫生部突发中毒事件卫生应急预案,本次事件属于一般级别突发中毒事件(Ⅳ级)[10]。
本次中毒事件的毒蘑菇保存不当,形态不完整,部分还有腐烂现象,无法进行形态学鉴定,用分子生物学的方法鉴定出毒蘑菇的种类为墨汁鬼伞、毛头鬼伞和丝盖伞属。墨汁鬼伞中含有鬼伞毒素,误食后发生剧烈的胃肠道症状,如恶心、呕吐、腹痛、腹泻等。治疗及时一般无生命危险,但中毒严重者偶有死亡,特别是对小儿易引起死亡[1]。毛头鬼伞的毒素主要为奥莱毒素,发病初期以胃肠道表现为主,2~4 d出现少尿、无尿、浮肿等肾功能衰竭症状,病程较长;化验指标中尿素氮与肌酐升高而且维持时间长[11]。丝盖伞属中毒后除有胃肠道症状外,主要临床初期出现意识模糊等症状,而后才表现为精神症状,出现精神兴奋、精神抑制和精神错乱或有幻觉反应等症状[12]。鉴定出的毒蘑菇的中毒临床表现和本次事件的临床表现相符。
在毒蘑菇中毒事件中往往难以采集到可用于形态学鉴定标本,只能从剩余食物、呕吐物或者洗胃液中提取样本用于鉴定,DNA分子标记鉴定技术更能发挥作用[13]。本次事件验证了分子生物学的鉴定方法可用于毒蘑菇中毒事件的处置,其鉴定结果为指导中毒患者临床救治和事件处置提供科学依据。
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