手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)的大部分病例1周内即获痊愈，少数重症患者出现无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、神经源性肺水肿和心肌炎等，个别重症患者病情进展快，可导致死亡。引起手足口病的肠道病毒有20余种，其中以肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)危害最大。EV71感染后神经系统并发症比例特别高，易导致神经源性肺水肿、循环功能衰竭；EV71是引起手足口病重症病例的主要病原体^{[1, 2]}。许多学者对重症手足口病患儿的临床特征及EV71的生物学特征进行了相关研究。但当前少见EV71病毒载量与临床因素相关性的研究报道。本文应用荧光定量PCR法检测了214例EV71型重症手足口病患儿的病毒载量，分析其与各个临床因素的相关性，以期进一步认识EV71病毒载量的临床意义。现将结果报道如下。

2014 年6月至2014年9月杭州市儿童医院收治的EV71感染的重症手足口病患儿214例，其诊断均符合卫生部颁布的《手足口病诊疗指南(2010年版)》的诊断标准^[3]，其中重型184例(86%)，危重型30例(14%)。所有患儿均经荧光定量PCR法检测咽拭子EV71病毒核酸阳性证实为EV71感染，且均排除其他肠道病毒感染。本研究已获得医院医学伦理委员会批准，并已取得214位患儿家长的知情同意。

214 例患儿中，男144例，女70例，男女比例2.06∶ 1；发病年龄0.42~7.67岁，发病中位年龄为2.50岁。5岁以内患儿为205例(95.8%)。院外病程0.5~10 d，中位病程为3 d。202例(94.4%)患儿在发病5 d内就诊。发热持续时间1~9 d，中位发热持续时间为5 d。有惊跳179例(83.6%)，肢体抖动116例(54.2%)，呕吐109例(50.9%)，头痛32例(14.9%)。本组病例均无惊厥或昏迷。外周血白细胞正常者95例，白细胞升高者119例，中位白细胞数为10.39×10⁹L^-1(8.19×10⁹L^-1，12.28×10⁹L^-1)。脑脊液有核细胞数正常者49例，脑脊液有核细胞数升高者例165例，中位脑脊液有核细胞数为70×10⁶L^-1(19.75×10⁶L^-1，140×10⁶L^-1)。脑脊液EV71-IgM阳性者129例(60.3%)，脑脊液EV71-IgM阴性者85例(39.7%)。血清EV71-IgM阳性者192例(89.7%)，血清EV71-IgM阴性者22例(10.3%)。头颅CT检查208例，检查结果均无异常。本组患儿均使用甘露醇降低颅内高压治疗，并予以小剂量甲基泼尼松龙1～2 mg/(kg·d)治疗2~3 d。30例危重型患儿除甘露醇、甲基泼尼松龙外，加用大剂量静脉丙种球蛋白(2.0 g/kg)及米力农注射液治疗。所有病例7～10 d均痊愈出院。

采集214例患儿入院当天的咽拭子样本，用专用采集棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，迅速将棉签放入采集管中，置于-20 ℃冰箱保存。所有标本均在24 h内完成实验室检测工作。

(1) 病毒核酸提取：取咽拭子标本上清液200 μL于1.5 mL离心管中，严格按照RNA提取试剂盒(苏州天隆生物科技有限公司)说明书操作，最终收集RNA提取液50 μL，-20℃保存备用。(2) PCR-荧光探针检测：使用实时荧光定量EV71型RNA检测试剂盒(广州中山大学达安基因股份有限公司)，在ABI 7500 荧光定量PCR仪(ABI公司，美国)上进行EV71病毒载量测定。以1×10⁷ copies/mL、1×10⁶ copies/mL、1×10⁵ copies/mL、1×10⁴ copies/mL、1×10³ copies/mL等5个滴度作一条标准曲线，分别以1×10⁷ copies/mL和1×10³ copies/mL两个滴度作为质控。检测结果以＞1×10³ copies/mL为阳性。具体操作按说明书进行。PCR扩增条件为：42 ℃ 25 min，1个循环；94 ℃ 3 min，1个循环；93 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，40个循环。

ELISA方法检测患儿血清和脑脊液标本中EV71 IgM抗体。抗体试剂盒由北京万泰生物药业股份有限公司提供。采用捕获法ELISA原理，微孔条上预包被的抗人IgM(抗u链)可与样品种的IgM抗体结合，洗板后加入抗原试剂与酶标试剂进行温育。当样品中存在对应IgM抗体时，将形成“抗u链-IgM抗体-抗原-酶标抗体”复合物。具体步骤详见操作说明书，每板设阴性对照3孔，阳性对照2孔和空白对照1孔。设定酶标仪波长于450 nm处，用空白孔调零点后测定各孔吸光度(A值)，按照说明书上标定的范围和标准判断阳性和阴性。

取患儿脑脊液进行常规检查；按照《全国临床检验操作规程》第3版中的规定操作，细胞计数>15×10⁶L^-1为阳性结果，离心取沉渣涂片，瑞氏染色后油镜下分类。

采用SPSS 16.0统计软件进行统计处理。计量资料用均数±标准差(x±s)(正态分布时)或中位数(四分位数间距)[M(Qr)](非正态分布时)表示；计数资料用构成比及率表示。两组间计量资料的比较采用秩和检验(非正态分布时)。病毒载量与各临床因素(非正态分布变量)的关系判定采用Sspearman相关分析,以P＜0.05为差异具有统计学意义。

214 例患儿的EV71病毒载量中，其中10³~10⁴拷贝数(copies/mL)145例(67.8%),10⁵~10⁶拷贝数61例(28.5%)，≥10⁷拷贝数8例(3.7%)。中位病毒载量为4×10⁴ copies/mL(6×10³copies/mL,2×10⁵ copies/mL)。

男性组和女性组患儿的病毒载量差异无统计学意义(Z=-0.112，P=0.911)(见表 1)，提示性别与EV71病毒载量无相关性。

EV71病毒载量分别与年龄、院外病程、发热持续时间、外周血白细胞数、脑脊液有核细胞数进行Spearman相关分析，结果显示EV71病毒载量与年龄无关(P=0.255)。EV71病毒载量与院外病程呈负相关(r=-0.194，P=0.004)。EV71病毒载量与发热持续时间无关(P=0.631)；EV71病毒载量与外周血白细胞数无关(P=0.329)。EV71病毒载量与脑脊液有核细胞数呈正相关(r=0.164，P=0.016)。

两组患儿的病毒载量差异无统计学意义(Z=-0.041，P=0.968)(表 2)。

两组患儿的病毒载量差异无统计学意义(Z=-1.467，P=0.142)(表 3)。

两组患儿的病毒载量差异无统计学意义(Z=-1.271，P=0.204)(表 4)，提示病情轻重程度与病毒载量无相关性。

肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科肠道病毒属A型。EV71可引起少数患儿出现临床预后较严重的神经系统综合征及心肺功能衰竭综合征^{[4, 5]}，严重危害儿童健康。目前EV71病毒感染的病理机制并不完全清楚^[6]。然而，一种病毒感染性疾病的发生，多与机体免疫力、病毒的种类、病毒毒力、病毒量有关。随着实时荧光定量PCR检测技术应用的不断成熟，EV71病毒载量成为医学研究新的关注点。

EV71病毒一般由口腔入胃肠道，首先在咽部和肠道淋巴组织中繁殖，发生病毒血症，随后病毒随血流进入全身各脏器组织。本研究采用荧光定量PCR法检测咽拭子标本中的病毒载量，结果提示咽拭子标本的中位病毒载量为4×10⁴ copies/mL，与符宗敏等^[7]所报道的咽拭子标本的病毒载量相近。

本文进一步分析了EV71病毒载量与各临床因素的关系，结果显示EV71病毒载量与性别、年龄无相关性。故笔者推测EV71侵入人体的病毒量是无性别选择及年龄差异的，人群普遍对EV71易感。本研究亦显示：EV71病毒载量与院外病程呈负相关。即院外病程越短(采集咽拭子标本的时间越早)，咽拭子标本中EV71病毒载量越高。分析其原因为：咽部是手足口病病毒最早感染繁殖的部位，且不断通过咽部向体外排毒^{[8, 9, 10]}；故越早采集咽拭子标本进行检测，所测得的EV71病毒载量越高。这也提示应尽早采集咽拭子标本进行检测，以提高病毒检测的阳性率。

既往多个研究表明外周血白细胞数升高、持续高热不退是重症手足口病的危险因素^{[11, 12, 13]}。本研究显示：发热持续时间、外周血白细胞数与病毒载量无关。这提示发热持续时间的长短、外周血白细胞数的多少与病毒载量的高低无直接关系，它们可能与病毒感染后所致的炎症反应有关。

EV71 病毒具有嗜神经性，其可通过直接感染和免疫损伤机制导致手足口病患者脑干和脊髓灰质的神经细胞出现炎症细胞浸润，神经元变性、坏死。有实验证明在中枢神经组织(包括大脑、中脑、脊髓)中，EV71病毒增殖可导致组织病理改变^[14]。本研究表明EV71病毒载量与脑脊液有核细胞数呈正相关。这提示EV71病毒载量越高，EV71病毒侵袭神经系统程度越严重，导致脑组织炎症渗出越严重，脑脊液有核细胞数升高越明显。

EV71病毒侵袭神经系统，机体的免疫系统受到激活，产生脑脊液EV71-IgM抗体。因IgM抗体相对分子量较大，不易透过血脑屏障，故脑脊液中检测出特异性EV71-IgM抗体是中枢神经系统感染的直接证据。本研究显示脑脊液EV71-IgM阳性组与脑脊液EV71-IgM阴性组之间的病毒载量无差异，即脑脊液EV71-IgM抗体与病毒载量无关。

EV71病毒侵入后诱导机体产生血清EV71-IgM抗体。本研究显示血清EV71-IgM阳性组与阴性组之间的EV71病毒载量无差异。这提示血清EV71-IgM阳性与否，与病毒载量高低无关。这可能是血清特异性病毒IgM抗体产生主要与机体的免疫有关，与侵入的病毒量多少无直接关系。

手足口病病毒载量与临床表现轻重之间是否存在相关性，目前研究报道较少。邓慧玲等^[15]对247例EV71感染患儿(其中普通型121例、重症126例)进行研究显示：重症EV71手足口病患儿与普通型EV71手足口病患儿的病毒载量差异无统计学意义，EV71型病毒载量高低与手足口病严重程度无明显相关性 。吴亦栋等^[16]亦研究证明EV71病毒载量与病情轻重程度无关 。本研究将重症EV71手足口病患儿进一步分为重型组及危重型组，比较两组的病毒载量，结果示两组的病毒载量差异无统计学意义，提示EV71病毒载量与病情严重程度无关，与上述研究结论一致。