中华急诊医学杂志  2016, Vol. 25 Issue (6): 714-718
内蒙古蒙汉族新生儿呼吸窘迫综合征研究
梅花, 张钰恒, 刘春枝, 张亚昱, 宋丹, 刘春丽, 新春, 王晶    
010050 呼和浩特,内蒙古医科大学附属医院新生儿科
摘要目的 研究肺表面活性物质蛋白B(SP-B)基因1580位点与内蒙古地区蒙汉族新生儿呼吸窘迫综合征(NRPS)的相关性。 方法 选择内蒙古医科大学附属医院151例患新生儿呼吸窘迫综合征的新生儿(病例组)与151例正常新生儿(对照组)作为研究对象,应用PCR基因分析技术及RFLP技术检测SP-B1580位点基因多态性。 结果 在内蒙古地区,不论蒙古族还是汉族,SP-B1580位点均可检出3种基因型:即TT、CT及CC型。蒙古族NRDS组与蒙古族正常对照组相比差异无统计学意义(χ2 =0.021,P=0.886)。汉族NRDS组与汉族正常对照组相比差异有统计学意义(χ2 =5.499,P=0.019),汉族NRDS组SP-B1580位点基因型以C等位基因为主。 结论 内蒙古汉蒙族新生儿SP-B基因型及等位基因频率在不同性别、出生体质量、胎龄、生产方式等中无明显关联。SP-B 1580C等位基因可能是内蒙古地区汉族儿童患新生儿呼吸窘迫综合征的易感基因之一。
关键词呼吸窘迫综合征     肺表面活性物质     蛋白质B     基因多态性     新生儿    
The anslysis of neonatal respiratory distress syndrome between the Han nationality and the Mongol nationality in Inner Mongolia
Mei Hua, Zhang Yuheng, Liu Chunzhi, Zhang Yayu, Song Dan, Liu Chunli, Xin Chun, Wang Jing    
Department of Neonatology, Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010050, China
Abstract: Objective To study the association between the SP-B gene polymorphisms and neonatal respiratory distress syndrome(NRDS) in infants of the Han nationality and the Mongol nationality. Methods One hundred and fifty-one infants with NRDS and another 151 infants without RDS (control group) were selected. PCR and RFLP were used to establish the genotype and allele frequencies of SP-B 1580 position. Results In the Inner Mongolia region, in both the Mongol nationality and the Han nationality, three genotypes namely TT, CT and CC could be can checked out from SP-B 1580 position . There were no significant differences in frequencies of TT genetype and CC genetype of SP-B 1580C/T between NRDS group and control group in Mongol nationality(χ2 =0.021,P=0.886). On the contrary, there were statistical difference inthe frequencies of TT genetype and CC genetype of SP-B 1580C/T between NRDS group and control group in Mongol nationality(χ2 =5.499,P=0.019). Conclusions The polymorphism of SP-B 1580 position in Inner Mongolia newborns displays no significant correlation with sex, birth weight or gestational age.The CC genetype of SP-B1580 might be the susceptibility genes of RDS in Han nationality in Inner Mongolia newborns.
Key words: Respiratory distress syndrome     Surfactant protein B     Single nucleotide polymorphisms     Newborn    

新生儿呼吸窘迫综合征(respiratory distress syndrome of newborn,NRDS) 是新生儿期较常见的危重症之一,是导致早产儿疾病与死亡的最主要原因,也是导致儿童慢性肺疾病的主要原因。NRDS是一种多因素、多基因参与的疾病,其发病主要机制是由于肺表面活性物质(pulmonary surfactant,PS)的缺乏,目前认为NRDS与肺表面活性物质蛋白(surfactant protein,SP)合成减少有很大的关系[1]。随着分子遗传学水平研究的不断进展,国内外研究均表明SP-B基因多态性与NRDS相关。本研究选择内蒙古地区蒙汉族NRDS患儿,着重研究蒙汉族NRDS与SP-B 1580位点基因多态性的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

病例组:选取2009年9月至2014年12月于内蒙古医科大学附属医院新生儿科住院的汉族NRDS患儿100例和蒙古族NRDS患儿51例。NRDS的诊断依据第4版《实用新生儿学》[2] NRDS诊断标准。对照组:选取同时间段内蒙古医科大学附属医院住院或母婴同室的汉族无NRDS新生儿100例和蒙古族无NRDS新生儿51例;纳入标准:①胸部X线片提示无肺部感染和NRDS表现;②血常规和CRP检查提示无感染者。实验分为2组:病例组(蒙古族NRDS组和汉族NRDS组)、对照组(蒙古族正常对照组和汉族正常对照组)。

病例组和对照组病例均需排除:①严重先天性疾病,如复杂型先天性心脏病、膈疝和脑发育不良等;②遗传代谢性疾病,如苯丙酮尿症、先天性甲状腺功能低下和糖尿病等;③母亲孕后期有明确感染史;④多胎;⑤母亲糖尿病;⑥生后窒息。本研究通过内蒙古医科大学伦理委员会批准及家属知情同意。

1.2 方法

标本采集、临床资料收集及提取DNA,抽取病例组和对照组新生儿静脉血0.5 mL,置于EDTA管中抗凝,-80℃冰箱保存,基因组DNA提取试剂盒(DP318,天根生化科技(北京)有限公司)购置于北京博奥森试剂公司,严格按照试剂盒说明书对样本提取DNA。收集所有新生儿性别、出生体质量及胎龄等相关临床资料。

所提取DNA进行PCR,限制性片段长度多态性(RFLP)分析,由北京安美生医药科技有限公司合成SP-B基因的上下游引物,分别是: 5 '- TGTGTGTGAGAGTGAGGGTGTAAG-3 '和5 '-CTGGTCATCGACTACTTCCA-5 '。从样本所提取出的DNA总量中取出1~2 μl作为待扩增的基因。使用TAKARA PCR Amplification Kit (Code No.:DR011,宝生物工程(大连)有限公司)进行PCR实验。SP-B基因片段扩增的PCR反应条件:94 ℃ 10 min,94℃ 40 s,56~62 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,72 ℃ 7min,循环38次,72℃延伸10 min。PCR扩增的产物总长度约为700 bp。使用3%的琼脂糖凝胶电泳检测,观察PCR产物的效果,确定其作为模板在RFLP分析中的质量。RFLP分析由北京安美生医药科技有限公司协助完成。

1.3 统计学方法

使用SPSS17.0统计软件对实验对象的一般情况、实验数据进行统计学分析。实验组与对照组一般情况中的性别、胎龄、出生体质量、是否促肺及出生方式的比较采用χ2检验;有关SP-B 1580位点基因多态性的比较亦采用χ2检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 一般情况的比较

病例组151例,胎龄29~41周,出生体质量1.1~3.15 kg。对照组151例,胎龄30~40周,出生体质量1.01~3.2 kg。两组患儿性别、胎龄、出生体质量、出生方式、是否规律促肺成熟等方面差异均无统计学意义(P>0.05)。见表 1

表 1 病例组及对照组患儿一般情况比较 Table 1 Comparison of general situation in two groups

指标

病例组对照组χ2P
民族
蒙古族5151--
汉族100100
胎龄(周)
≥3718200.5620.755
34~ <3737 45
<349686
性别
81781.3720.242
7073
出生体质量(kg)
≥2.521304.0480.132
1.5~<2.54846
<1.58275
生产方式
剖宫产94850.0270.869
顺产5766
规律促肺
48601.3320.249
10391
2.2 基因多态性

SP-B 1580C/T位点基因多态性碱基序列图,见图 13

2.3 蒙古族NRDS组与蒙古族正常对照组SP-B 1580位点基因多态性的比较

图 1 SP-B基因1580位点CC基因型 Fig. 1 SP-B1580CC

图 2 SP-B基因1580位点CT基因型 Fig. 2 SP-B1580CT

图 3 SP-B基因1580位点TT基因型 Fig. 3 SP-B1580TT
蒙古族NRDS组和蒙古族正常对照组中SP-B1580位点基因型均可检出3种基因型:即TT、CT及CC型。两组中SP-B 1580位点基因型经过遗传学平衡检验,均符合Hardy-Weinbery平衡定律(χ2=0.380 9,0.211 2,P>0.05),说明以上各组人群基因型均符合遗传平衡,具有群体代表性。两组之间关于SP-B1580位点基因多态性的比较差异无统计学意义。见表 2

表 2 SP-B 1580在蒙古族NRDS组和蒙古族正常对照组的分布[例,%] Table 2 The distributions of genotype and allele of SP-B 1580 in the Mongol nationality NRDS group and the Mongol nationality control group[case,(%)]
组别(例数) 基因型频率 等位基因频率
TTCTCC TC
病例组11 18 22 40 62
(n=51)(21.6)(35.3)(43.1)(39.2)(60.8)
对照组9 21 21 39 63
(n=51)(17.6)(41.2) (41.1) (38.2) (61.8)
χ20.4540.021
P0.7970.886
2.4 汉族 NRDS组与汉族正常对照组SP-B 1580位点基因多态性的比较

汉族NRDS组和汉族正常对照组中SP-B员1580位点基因型同样可检出3种基因型:即TT、CT及CC型。两组中SP-B 1580位点基因型经过遗传学平衡检验,均符合Hardy-Weinbery平衡定律(χ2 =0.597 1,1.075 5,P>0.05),说明以上各组人群基因型均符合遗传平衡,具有群体代表性。两组之间关于SP-B 1580位点基因多态性的比较差异有统计学意义。见表 3

表 3 SP-B 1580在汉族NRDS组和汉族正常对照组的分布(例,%) Table 3 The distributions of genotype and allele of SP-B 1580 in the Han nationality NRDS group and the Han nationality control group(case,%)
组别(例数) 基因型频率 等位基因频率
TTCTCC TC
病例组927 64 45155
(n=100)(9.0) (27.0) (64.0) (19.5) (80.5)
对照组13 40 4766 134
(n=100)(13.0) (40.0) (47.0)(33.0) (67.0)
χ25.8535.499
P值0.0540.019
3 讨论

SP-B基因位于人类2号染色体的短臂上,长度约9 500 bp,由11个外显子和10个内含子组成,主要功能为降低肺泡表面张力、帮助表面活性物质在肺泡表面的分布并维持其稳定性[3]。SP-B的合成受发育和基因双重调节[4]。SP-B基因与NRDS、BPD等多种肺疾病相关[5],且其多态性有种族差异[6],而种族背景差异是分析等位基因和基因型频率的重要影响因素。对于SP-B 1580位点与NRDS的关系国内外的多项研究结论均不一致。本研究主要比较内蒙古地区蒙汉族NRDS患儿与正常新生儿之间的SP-B 1580位点基因多态性的相关性,结果发现蒙古族NRDS组和蒙古族正常对照组之间无差异,说明SP-B 1580位点基因多态性与内蒙古地区蒙古族NRDS无相关性,这可能与样本量小、位点选择、民族差异、地理环境等因素均相关。国内潘睿等[7]曾将武汉汉族新生儿SP-B 1580等位基因频率与德国高加索人、美国白种人及日本人相比较,结果发现武汉汉族新生儿SP-B 1580等位基因频率与德国高加索人和美国白种人差异有统计学意义,而与日本人相比差异无统计学意义,这再次证明SP-B 1580位点基因多态性分布在不同种族人群中存在差异。

SP-B基因1580位点(rs1130866)位于SP-B基因第4外显子上,Lin等[8]发现,SP-B 1580基因多态性是NRDS的易感因素;Flores等[9]通过检测RDS患儿及其父母的1580C/T位点多态性,直接证实该位点与RDS相关。大多数研究表明,SP-B 1580基因CC基因型可能导致NRDS发生的风险更大,本研究有类似的发现:SP-B 1580C等位基因可能是内蒙古地区汉族NRDS的易感基因之一。Marttila等[10]研究同样得出类似结论:SP-B 1580基因C等位基因是NRDS的易感因素,C等位基因可以增加双胞胎中先露胎儿患RDS的风险;小于32周的早产儿的SP-B 1580位点多为CC基因型[11];Yin等[8]研究发现SP-B 1580C/C基因型与NRDS相关;曾凌空等[12]、卢维城等[13]在研究SP-B基因多态性与NRDS易感性的关系时证实C等位基因型可能参与NRDS的发生发展,携带C等位基因的早产儿患RDS的相对危险度为携带其他基因型的2.26倍;而Lyra等[14]发现NRDS患儿SP-B1580位点CC、CT、TT基因型频率没有显著差异。近年笔者也对SP-C基因多态性与内蒙古地区新生儿呼吸窘迫综合征的相关性进行研究,发现SP-C基因外显子4(T138N)、外显子5(S186N)位点与内蒙古地区蒙汉族NRDS无明显相关性[15, 16]。因此有必要进行大样本、多民族、多中心、严密设计的研究支持,以期丰富少数民族基因库数据,并为疾病的个体化预防和治疗提供依据。

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