新生儿呼吸窘迫综合征(respiratory distress syndrome of newborn,NRDS) 是新生儿期较常见的危重症之一,是导致早产儿疾病与死亡的最主要原因,也是导致儿童慢性肺疾病的主要原因。NRDS是一种多因素、多基因参与的疾病,其发病主要机制是由于肺表面活性物质(pulmonary surfactant,PS)的缺乏,目前认为NRDS与肺表面活性物质蛋白(surfactant protein,SP)合成减少有很大的关系[1]。随着分子遗传学水平研究的不断进展,国内外研究均表明SP-B基因多态性与NRDS相关。本研究选择内蒙古地区蒙汉族NRDS患儿,着重研究蒙汉族NRDS与SP-B 1580位点基因多态性的相关性。
1 资料与方法
1.1 一般资料
病例组:选取2009年9月至2014年12月于内蒙古医科大学附属医院新生儿科住院的汉族NRDS患儿100例和蒙古族NRDS患儿51例。NRDS的诊断依据第4版《实用新生儿学》[2] NRDS诊断标准。对照组:选取同时间段内蒙古医科大学附属医院住院或母婴同室的汉族无NRDS新生儿100例和蒙古族无NRDS新生儿51例;纳入标准:①胸部X线片提示无肺部感染和NRDS表现;②血常规和CRP检查提示无感染者。实验分为2组:病例组(蒙古族NRDS组和汉族NRDS组)、对照组(蒙古族正常对照组和汉族正常对照组)。
病例组和对照组病例均需排除:①严重先天性疾病,如复杂型先天性心脏病、膈疝和脑发育不良等;②遗传代谢性疾病,如苯丙酮尿症、先天性甲状腺功能低下和糖尿病等;③母亲孕后期有明确感染史;④多胎;⑤母亲糖尿病;⑥生后窒息。本研究通过内蒙古医科大学伦理委员会批准及家属知情同意。
1.2 方法
标本采集、临床资料收集及提取DNA,抽取病例组和对照组新生儿静脉血0.5 mL,置于EDTA管中抗凝,-80℃冰箱保存,基因组DNA提取试剂盒(DP318,天根生化科技(北京)有限公司)购置于北京博奥森试剂公司,严格按照试剂盒说明书对样本提取DNA。收集所有新生儿性别、出生体质量及胎龄等相关临床资料。
所提取DNA进行PCR,限制性片段长度多态性(RFLP)分析,由北京安美生医药科技有限公司合成SP-B基因的上下游引物,分别是: 5 '- TGTGTGTGAGAGTGAGGGTGTAAG-3 '和5 '-CTGGTCATCGACTACTTCCA-5 '。从样本所提取出的DNA总量中取出1~2 μl作为待扩增的基因。使用TAKARA PCR Amplification Kit (Code No.:DR011,宝生物工程(大连)有限公司)进行PCR实验。SP-B基因片段扩增的PCR反应条件:94 ℃ 10 min,94℃ 40 s,56~62 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,72 ℃ 7min,循环38次,72℃延伸10 min。PCR扩增的产物总长度约为700 bp。使用3%的琼脂糖凝胶电泳检测,观察PCR产物的效果,确定其作为模板在RFLP分析中的质量。RFLP分析由北京安美生医药科技有限公司协助完成。
1.3 统计学方法
使用SPSS17.0统计软件对实验对象的一般情况、实验数据进行统计学分析。实验组与对照组一般情况中的性别、胎龄、出生体质量、是否促肺及出生方式的比较采用χ2检验;有关SP-B 1580位点基因多态性的比较亦采用χ2检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 一般情况的比较病例组151例,胎龄29~41周,出生体质量1.1~3.15 kg。对照组151例,胎龄30~40周,出生体质量1.01~3.2 kg。两组患儿性别、胎龄、出生体质量、出生方式、是否规律促肺成熟等方面差异均无统计学意义(P>0.05)。见表 1。
指标 | 病例组 | 对照组 | χ2值 | P值 |
民族 | ||||
蒙古族 | 51 | 51 | - | - |
汉族 | 100 | 100 | ||
胎龄(周) | ||||
≥37 | 18 | 20 | 0.562 | 0.755 |
34~ <37 | 37 | 45 | ||
<34 | 96 | 86 | ||
性别 | ||||
男 | 81 | 78 | 1.372 | 0.242 |
女 | 70 | 73 | ||
出生体质量(kg) | ||||
≥2.5 | 21 | 30 | 4.048 | 0.132 |
1.5~<2.5 | 48 | 46 | ||
<1.5 | 82 | 75 | ||
生产方式 | ||||
剖宫产 | 94 | 85 | 0.027 | 0.869 |
顺产 | 57 | 66 | ||
规律促肺 | ||||
是 | 48 | 60 | 1.332 | 0.249 |
否 | 103 | 91 |
SP-B 1580C/T位点基因多态性碱基序列图,见图 1~3。
2.3 蒙古族NRDS组与蒙古族正常对照组SP-B 1580位点基因多态性的比较
蒙古族NRDS组和蒙古族正常对照组中SP-B1580位点基因型均可检出3种基因型:即TT、CT及CC型。两组中SP-B 1580位点基因型经过遗传学平衡检验,均符合Hardy-Weinbery平衡定律(χ2=0.380 9,0.211 2,P>0.05),说明以上各组人群基因型均符合遗传平衡,具有群体代表性。两组之间关于SP-B1580位点基因多态性的比较差异无统计学意义。见表 2。
组别(例数) | 基因型频率 | 等位基因频率 | ||||
TT | CT | CC | T | C | ||
病例组 | 11 | 18 | 22 | 40 | 62 | |
(n=51) | (21.6) | (35.3) | (43.1) | (39.2) | (60.8) | |
对照组 | 9 | 21 | 21 | 39 | 63 | |
(n=51) | (17.6) | (41.2) | (41.1) | (38.2) | (61.8) | |
χ2 | 0.454 | 0.021 | ||||
P值 | 0.797 | 0.886 |
汉族NRDS组和汉族正常对照组中SP-B员1580位点基因型同样可检出3种基因型:即TT、CT及CC型。两组中SP-B 1580位点基因型经过遗传学平衡检验,均符合Hardy-Weinbery平衡定律(χ2 =0.597 1,1.075 5,P>0.05),说明以上各组人群基因型均符合遗传平衡,具有群体代表性。两组之间关于SP-B 1580位点基因多态性的比较差异有统计学意义。见表 3。
组别(例数) | 基因型频率 | 等位基因频率 | ||||
TT | CT | CC | T | C | ||
病例组 | 9 | 27 | 64 | 45 | 155 | |
(n=100) | (9.0) | (27.0) | (64.0) | (19.5) | (80.5) | |
对照组 | 13 | 40 | 47 | 66 | 134 | |
(n=100) | (13.0) | (40.0) | (47.0) | (33.0) | (67.0) | |
χ2 | 5.853 | 5.499 | ||||
P值 | 0.054 | 0.019 |
SP-B基因位于人类2号染色体的短臂上,长度约9 500 bp,由11个外显子和10个内含子组成,主要功能为降低肺泡表面张力、帮助表面活性物质在肺泡表面的分布并维持其稳定性[3]。SP-B的合成受发育和基因双重调节[4]。SP-B基因与NRDS、BPD等多种肺疾病相关[5],且其多态性有种族差异[6],而种族背景差异是分析等位基因和基因型频率的重要影响因素。对于SP-B 1580位点与NRDS的关系国内外的多项研究结论均不一致。本研究主要比较内蒙古地区蒙汉族NRDS患儿与正常新生儿之间的SP-B 1580位点基因多态性的相关性,结果发现蒙古族NRDS组和蒙古族正常对照组之间无差异,说明SP-B 1580位点基因多态性与内蒙古地区蒙古族NRDS无相关性,这可能与样本量小、位点选择、民族差异、地理环境等因素均相关。国内潘睿等[7]曾将武汉汉族新生儿SP-B 1580等位基因频率与德国高加索人、美国白种人及日本人相比较,结果发现武汉汉族新生儿SP-B 1580等位基因频率与德国高加索人和美国白种人差异有统计学意义,而与日本人相比差异无统计学意义,这再次证明SP-B 1580位点基因多态性分布在不同种族人群中存在差异。
SP-B基因1580位点(rs1130866)位于SP-B基因第4外显子上,Lin等[8]发现,SP-B 1580基因多态性是NRDS的易感因素;Flores等[9]通过检测RDS患儿及其父母的1580C/T位点多态性,直接证实该位点与RDS相关。大多数研究表明,SP-B 1580基因CC基因型可能导致NRDS发生的风险更大,本研究有类似的发现:SP-B 1580C等位基因可能是内蒙古地区汉族NRDS的易感基因之一。Marttila等[10]研究同样得出类似结论:SP-B 1580基因C等位基因是NRDS的易感因素,C等位基因可以增加双胞胎中先露胎儿患RDS的风险;小于32周的早产儿的SP-B 1580位点多为CC基因型[11];Yin等[8]研究发现SP-B 1580C/C基因型与NRDS相关;曾凌空等[12]、卢维城等[13]在研究SP-B基因多态性与NRDS易感性的关系时证实C等位基因型可能参与NRDS的发生发展,携带C等位基因的早产儿患RDS的相对危险度为携带其他基因型的2.26倍;而Lyra等[14]发现NRDS患儿SP-B1580位点CC、CT、TT基因型频率没有显著差异。近年笔者也对SP-C基因多态性与内蒙古地区新生儿呼吸窘迫综合征的相关性进行研究,发现SP-C基因外显子4(T138N)、外显子5(S186N)位点与内蒙古地区蒙汉族NRDS无明显相关性[15, 16]。因此有必要进行大样本、多民族、多中心、严密设计的研究支持,以期丰富少数民族基因库数据,并为疾病的个体化预防和治疗提供依据。
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