2016, Vol. 25
430060 武汉，武汉大学人民医院麻醉科(薛锐)
Department of Anethesiology,Renmin Haspital of Wuhan University,Wuhan 430060,China(Xue R)
缺血-再灌注(IR)治疗是抢救缺血性疾病患者的主要措施，心肌缺血后尽早实现有效再灌注，挽救濒临死亡心肌，使心肌的结构和功能得到恢复，但是，再灌注损伤降低了早期再灌注带来的益处。缺血后处理(ischemic postconditioning,IPO)可明显减轻缺血-再灌注损伤，已被多项实验证实，由于临床操作性强，疗效显著，这一保护措施已应用于心脏瓣膜置换、心脏介入治疗等临床中 [1] 。然而IPO心肌保护措施在糖尿病状态下的效应报道结论不同，一些学者认为，糖尿病可使心肌保护效应增强[2] ,另一些学者认为IPO在糖尿病状态下心肌保护的效应减弱[3, 4]。本实验通过建立大鼠Ⅱ型糖尿病模型、心肌缺血-再灌注(IR)模型、IPO模型，观察保护性脂肪因子及其相关通路与氧化应急、促炎性细胞因子、心肌坏死标志物及心肌梗死面积间关系，评价糖尿病状态下IPO对心肌的保护作用，探讨其作用机制及在糖尿病心肌梗死患者中缺血后处理的使用价值。
1 材料与方法 1.1 实验动物采用健康成年雄性SD大鼠，体质量220~250 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。
1.2 动物模型的建立 1.2.1 大鼠糖尿病模型的建立将90只健康雄性SD 大鼠先喂以高脂高果糖饲料4周，按照大鼠体质量，以30 mg/kg的剂量腹腔注射1%的链脲佐菌素-柠檬酸盐缓冲液，做好记录。对照组中，按照体质量腹腔注射柠檬酸盐缓冲液。注射后自由进食饮水，同时监测大鼠的饮食量、饮水量和尿量。72 h后当血糖浓度>16.7 mmol/L 并持续1周以上时表示糖尿病鼠模型诱导成功。所有实验在成模8周后开始，实验期间每周监测血糖水平、胰岛素水平一次。
1.2.2 心肌缺血-再灌注损伤及IPO模型的建立糖尿病心肌缺血-再灌注模型大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉并固定于实验台上，气管插管连接小动物呼吸机。在大鼠四肢皮下及胸前插入针性电极，连接小动物心电图仪。左侧第四肋间开胸，剪开心包膜，充分暴露心脏。在左心耳的下缘处可以观察到一白线状血管，即为冠脉左前降支,其刚好位于肺动脉圆锥下缘约2 mm处,用6-0带线手术针进行穿线结扎，见心尖部位以及左心室前壁变白，心电图可见ST 段即刻抬高,T波变高，提示结扎部位正确。结扎30 min后，松开结扎线恢复血流，可观察到左心室恢复红润，ST段回落。糖尿病心肌缺血-再灌注及IPO模型的建立：解除移液枪头的套叠状态即可恢复血供进行再灌注。缺血-再灌注组在缺血30 min后，重新套叠移液枪头又可结扎左前降支，并于再灌注前实施缺血后处理(灌注10 s，缺血10 s)3个循环，再灌注120 min。S组仅以丝线穿过冠状动脉前降支但不结扎。再灌注120 min后处死大鼠。
1.3 实验分组造模成功的野生型成年雄性SD大鼠随机(随机数字法)分为6组：正常假手术组(NS组，n=10)、正常心肌缺血-再灌注组(NIR组，n=16)、正常缺血后处理组(NIPO组，n=16)、糖尿病假手术组(DMS组，n=10)、糖尿病心肌缺血-再灌注组(DMIR组，n=16)和糖尿病缺血后处理组(DMIPO组，n=16)。
1.4 观察指标及技术方法 1.4.1 测量心肌缺血及心肌梗死面积除NS组、DMS组外，各组随机取8只大鼠心脏，于再灌注120 min时，经股静脉注射1%Evans Blue 2 mL，取下心脏，置于-20℃ 30 min后，从心尖到心底缝线结扎部位分成三段，在中段同一平面垂直于长轴方向将其切成2 mm厚的薄片，置于l％TTC溶液(Sigma公司，美国)中37 ℃孵育20 min。存活的心肌呈蓝色，缺血区心肌呈砖红色，梗死区心肌呈灰白色。采用Imag-Pro软件(Media Cybemetics公司，美国)分析计算梗死心肌与全部左心室心肌面积比。各组取其平均数。
1.4.2 血浆检测指标采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血浆中脂联素的含量。比色法测定血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白T(cTnT)、超氧化物岐化酶(SOD)含量。硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)含量。放射免疫法测定血清白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量。
1.4.3 心肌细胞因子水平的检测心肌细胞因子水平的检测：每组大鼠自前降支结扎线以下心尖部取左心室缺血心肌组织100 mg，加入1 000 μL RIPA裂解液，测量蛋白含量，SDS-PAGE电泳、转膜、封闭、抗体孵育、显影，Odyssey红外扫描显影仪扫描荧光条带，Quantity one软件进行灰度测量，以目的蛋白与内参蛋白的灰度比值作为蛋白相对表达量。
1.5 统计学方法采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料用均数±标准差(x±s)表示。组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t法。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 各组大鼠心肌梗死范围比较与NIR组比较，NIPO组心梗面积减小(P<0.05)，而DMIR组及DMIPO组的心梗面积显著增大(P<0.01)；与DMIR组比较，DMIPO组的心梗面积无明显变化(P>0.05)；与NIPO比较，DMIR组及DMIPO组的心梗面积显著增大(P<0.01)。见表 1、图 1。
| 组别 | 缺血面积(%) | 梗死面积(%) |
| NIR组 | 54.1±5.2 | 33.2±4.3 |
| NIPO组 | 48.9±5.5 | 23.8±4.7a |
| DMIR组 | 51.2±4.6 | 44.8±5.7b |
| DMIPO组 | 49.6±6.4 | 42.9±5.4b |
| 注：与NIR组比较，a P<0.05，b P<0.01 | ||
 |
| 存活的心肌呈蓝色，缺血区心肌呈砖红色，梗死区心肌呈灰白色;A：NIR组，灰白色梗死区范围占30%左右，砖红色缺血区超过50%，蓝色存活的心肌范围在20%以内；B：NIPO组，灰白色梗死区范围占20%左右，与NIR组比较明显缩小，蓝色存活的心肌范围在20%~30%之间，与NIR组比较明显扩大；C：DMIR：灰白色梗死区范围占44%左右，与NIR组比较显著扩大，蓝色存活的心肌范围<10%；D：DMIPO组，与DMIR组比较灰白色梗死区范围及蓝色存活的心肌范围差异无统计学意义 图 1 各组大鼠心肌梗死面积比较 |
与NIR组比较，NIPO组CK-MB及cTnT水平显著降低(P<0.01)；与DMIR组比较，DMIPO组CK-MB和cTnT水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表 2。
| 组别 | 鼠数(只) | CK-MB(U/L) | cTnT(ng/mL) |
| NS组 | 10 | 674.34±54.24 | 0.24±0.01 |
| NIR组 | 16 | 2 154.76±72.14c | 3.95±0.48c |
| NIPO组 | 16 | 1 208.64±52.89a | 1.72±0.14a |
| DMS组 | 10 | 549.08±45.24 | 0.32±0.02 |
| DMIR组 | 16 | 2 245.84±62.61d | 4.34±0.36d |
| DMIPO组 | 16 | 2 185.86±66.08b | 4.09±0.21b |
| 注：与NIR组比较，a P<0.01;与DMIR组比较，b P>0.05;与NS组比较，c P<0.01；与DMS组比较，d P<0.01 | |||
与NIR组比较，NIPO组SOD显著升高(P<0.01)，MAD降低(P<0.05)；与DMIR组比较，DMIPO组SOD及MAD差异无统计学意义(P>0.05)。见表 3。
| 组别 | 鼠数(只) | SOD(ng/mL) | MAD (nmol/mL) |
| NS组 | 10 | 60.36±4.23 | 6.34±0.12 |
| NIR组 | 16 | 41.24±4.67d | 9.36±0.23d |
| NIPO组 | 16 | 58.18±3.84ad | 8.04±0.18bde |
| DMS组 | 10 | 53.22±4.17 | 6.52±0.14 |
| DMIR组 | 16 | 37.28±2.32d | 8.95±0.21d |
| DMIPO组 | 16 | 38.48±3.40a | 8.22±0.43c |
| 注：与NIR组比较，a P<0.01,b P<0.05；与DMIR组比较，c P>0.05；与NS组及DMS组比较，d P<0.01,e P<0.05 | |||
与NIR组比较，NIPO组IL-1β及TNF-α显著降低(P<0.01)，IL-6降低(P<0.05)；与DMIR组比较，DMIPO组血清IL-1β、IL-6和TNF-α含量差异无统计学意义(P>0.05)，见表 4。
| 组别 | 鼠数 (只) | IL-1β (ng/mL) | IL-6 (pg/mL) | TNF-α (ng/mL) |
| NS组 | 10 | 0.28±0.15 | 132.41±28.01 | 1.52±0.21 |
| NIR组 | 16 | 0.58±0.10a | 296.32±44.32a | 3.54±0.15a |
| NIPO组 | 16 | 0.45±0.11ac | 240.89±32.45bd | 2.75±0.28ac |
| DMS组 | 10 | 0.32±0.14 | 142.83±25.47 | 1.98±21.05 |
| DMIR组 | 16 | 0.64±0.08a | 342.18±32.48a | 3.75±0.36a |
| DMIPO组 | 16 | 0.62±0.13ae | 329.40±22.54ae | 3.65±0.24ae |
| 注：与NS组及DMS组比较，a P<0.01,b P<0.05;与NIR组比较,c P<0.01,d P<0.05;与DMIR组比较，e P>0.05 | ||||
与NS组比较，NIR组和NIPO组血清脂联素和p-Akt蛋白表达显著上调(P<0.01 或P<0.05)；DMS组p-Akt蛋白表达显著下调(P<0.05)；其 余各组APN及p-Akt蛋白表达下调，但差异无统计学意义(P>0.05)。与NIPO比较，DMS组、DMIR组及DMIPO组APN和p-Akt蛋白表达下调(P<0.01或P<0.05)；6组大鼠心肌组织总p-Akt蛋白表达差异无无统计学意义(P>0.05)。见表 5、图 2、图 3。 血浆APN的表达水平与心肌梗死面积呈负相关，而与心肌组织中p-Akt表达水平呈正相关，两者的相关系数分别为0.63和0.65(P<0.01)。
| 组别 | 鼠数 (只) | APN (mg/L) | p-Akt | Total-Akt |
| NS组 | 8 | 8.49±0.77 | 6.86±1.71 | 9.72±1.91 |
| NIR组 | 16 | 13.09±1.66e | 12.32±1.42b | 12.13±1.51 |
| NIPO组 | 16 | 15.63±1.99acdf | 14.79±2.01acdf | 11.22±2.76 |
| DMS组 | 8 | 4.27±1.44 | 2.54±1.41b | 9.51±2.01 |
| DMIR组 | 16 | 5.25±1.30 | 5.86±1.76 | 9.54±1.73 |
| DMIPO组 | 16 | 5.01±1.56 | 4.75±1.01 | 10.31±2.30 |
| 注：与NS组比较，a P<0.01,b P<0.05；与DMS组比较c P<0.01；与DMIR组比较，d P<0.01，e P<0.05；与DMIPO组比较，f P<0.05 | ||||
 |
| P-Akt：磷酸化蛋白激酶B；Total-Akt：总蛋白激酶B。1：NS组；2：NIR组；3：NIPO组：4：DMS组；5：DMIR组；6：DMIPO组 图 2 各组大鼠心肌组织p-Akt和Total-Akt蛋白表达 |
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| 与NS组比较,aP<0.05，bP<0.01；与DMS组比较，cP<0.01；与DMIR组比较， dP<0.01，与DMIPO组比较，eP<0.05 图 3 缺血后处理对正常与糖尿病心肌p-Akt及total-Akt蛋白表达的影响 |
缺血后处理(IPO)能减轻氧化应激损伤，减少线粒体钙超载，减缓凋亡细胞的死亡[5]，激活再灌注损伤抢救激酶通路、线粒体ATP敏感钾离子通道及抑制线粒体渗透孔道的开放等[6]，进而减少心肌梗死面积，改善心功能。随着防治缺血-再灌注损伤基础理论研究的不断深入，更接近临床实用的缺血后处理及缺血预处理方面研究做了大量工作[7, 8]，但在糖尿病心肌缺血-再灌注损伤，缺血后处理的影响、分子机制及临床应用可能性研究较少，本实验通过观察正常及糖尿病大鼠缺血-再灌注及IPO大鼠心肌梗死面积和心肌损伤标志物的释放，探讨在糖尿病大鼠IPO是否能减少缺血-再灌注损伤及其机制，推测临床应用的可能性。
氧化应激和早期炎症反应是心肌再灌注损伤的两个主要病理机制，再灌注过程中大量氧自由基和活性氧产生可直接损伤心肌细胞，他们与组成细胞的脂质、蛋白质及核酸等直接反应，导致细胞结构和功能改变，引起细胞损伤和死亡[9]。SOD是一种广泛存在于生物体内的金属酶，它可清除生物体内再利用氧的过程中产生的超氧阴离子。MDA是生物膜发生脂质过氧化的重要产物，其含量是衡量氧自由基对细胞损害的标志之一。本实验表明，IPO能显著提高正常大鼠心肌缺血-再灌注后血清SOD含量，降低血清MDA含量，增加机体对超氧负离子的清除，保护心肌细胞，抑制再灌注时氧化应激对心肌的损害。但IPO不能提高糖尿病大鼠心肌缺血-再灌注后血清SOD含量，不能降低血清MDA含量，不能减轻再灌注时氧化应激对心肌的损害。
缺血-再灌注过程中，氧化应急与早期炎症的触发有着密切的关系[10]。促炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α在再灌注过程中大量释放，进一步诱导细胞因子的级联反应，上调黏附分子和炎症趋化因子，加速中性粒细胞和单核细胞浸润心肌组织，激活中性粒细胞和巨嗜细胞，可引起呼吸爆发，释放大量氧自由基，导致心肌收缩力减弱和心肌细胞凋亡等不可逆性心肌损伤。本实验研究发现，IPO显著降低血清促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α在再灌注过程中大量释放，减小心肌梗死面积及心肌细胞损伤程度，但在糖尿病大鼠IPO上述保护作用不明显。
APN是Scherer等[11]于1995年从鼠的脂肪细胞中克隆出的一种新cDNA，近十年的实验与临床[12]发现APN主要有三种生物学功能：胰岛素增敏/代谢调节功能(主要是肝脏和肌肉)；抗炎/血管保护功能；抗缺血心肌保护功能。APN高表达，通过对巨噬细胞抗炎表型极化的抑制作用，可以制止代谢和心血管疾病恶化[13]。大量流行病学调查显示伴有高血糖的肥胖和糖尿病患者中，APN水平降低，且APN水平越低，其患心血管疾病风险越高。血浆APN浓度与与胰岛素水平负相关。APN表达分泌受体内一些炎症因子、转录因子、激素等因素调节，如炎症因子TNF-α、IL-6等炎症介质抑制APN的表达分泌，其中TNF-α可通过强烈抑制APN启动子的活性而发挥作用。在肥胖状态大多数脂肪因子是上调的，通常充当前炎症介质促进疾病过程。相反，APN因肥胖而下调[14]。Shibata等[15]和Tao等[16]证实APN敲除小鼠对心肌缺血-再灌注损伤易感性增加，并且在再灌注前给予APN的重组体，可以显著减少心肌梗死面积。这些结果提示在Ⅱ型糖尿病患者中，APN水平降低，不仅促进了缺血性心肌病的发生，还加重了缺血-再灌注后心肌细胞死亡。因此，APN具有抗炎/血管保护功能，及抗缺血心肌保护功能。本研究结果缺血-再灌注尤其是缺血后处理引起APN显著升高，而糖尿病心肌中，APN表达受到抑制，且缺血-再灌注损伤与后处理均不能上调其表达水平，心肌梗死面积增大。
PI3K/Akt信号转导通路是维持细胞周期运行，抑制细胞凋亡，促进细胞生长增殖的重要因素。在心肌细胞中PI3K/Akt通路的激活可减轻胞内钙超载，维持线粒体膜稳定性，防止因线粒体mPTP的开放而导致的后续氧化损伤和凋亡反应，是心肌细胞重要的内源性抗氧化防御机制[17]。而缺血后处理作为重要的机体内源性保护措施，可通过PI3K/Akt通路激活发挥保护作用。研究发现糖尿病心肌缺血-再灌注损伤后缺血后处理的保护作用消失，进一步研究显示缺血后处理保护作用消失的机制与PI3K/Akt通路失活密切相关[18, 19]。Wang等[20]证实N-乙酰半胱氨酸和别嘌呤醇协同减弱糖尿病大鼠心肌缺血-再灌注损伤机制是通过APN上调PI3K/Akt通路而实现。与本研究结果相一致。
本实验证实正常大鼠缺血-再灌注期间及缺血后处理后心肌梗死面积逐渐减小，心肌损伤坏死程度显著减轻，APN表达及活化Akt通道蛋白量依次增高；而在糖尿病大鼠APN表达及活化Akt通道蛋白量降低，且缺血-再灌注、缺血后处理均不能上调APN表达，相关Akt通道蛋白活化量亦降低，APN的低表达及PI3K/Akt通路失活作用下增加了糖尿病心肌对缺血的敏感度，与Smith和Yellon[21] 研究结果相似，表明糖尿病缺血-再灌注损伤加重及缺血后处理无法实现对糖尿病心肌缺血的保护作用。本研究结果表明在正常心肌缺血-再灌注及缺血后处理引起APN升高且伴随着p-Akt的升高，APN与p-Akt的表达呈显著正相关。而糖尿病心肌中APN表达受到抑制，且缺血-再灌注损伤与缺血后处理均不能上调其表达，p-Akt的低表达使其无法通过调节PI3K/Akt信号通路而发挥保护作用。
IPO能减少缺血-再灌注大鼠心肌梗死面积，但在糖尿病大鼠IPO不能减少缺血-再灌注大鼠心肌梗死面积，本研究提示其可能机制：糖尿病大鼠IPO不能提高保护性因子水平如血清APN、SOD等；糖尿病大鼠IPO不能降低损伤性因子水平如MDA及降低血清促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α在再灌注过程中大量释放；糖尿病大鼠IPO保护作用消失的机制与PI3K/Akt通路失活密切相关。提示糖尿病患者合并急性心肌梗死不能通过缺血后处理减少心肌梗死面积，改善预后。缺血后处理不适用于糖尿病心肌梗死等相关缺血-再灌注损伤患者的预防。
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