百草枯(paraquat，PQ)中毒所致急性肺损伤表现为早期肺泡上皮细胞受损，肺泡腔内出血，肺间质水肿伴炎症细胞浸润。晚期肺泡结构破坏、肺间质增生、肺泡萎缩及间质纤维化^[1]，这种表现被命名为“百草枯肺”，是急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的一种变异形式^[2]。PQ中毒目前治愈率低、导致进行性不可逆肺纤维化，出现顽固低氧血症，最终致患者死亡^{[3, 4, 5]}。

将清洁级Wistar 雄性大鼠 45只，体质量为200~250 g，购于四川大学实验动物中心，动物实验资格认可证：川动管第 2005-853 号。 20%PQ购自河北桃园农药有限公司(批号 20080606，避光保存)。 DAS 由美国Sigma公司生产，小鼠抗大鼠多克隆抗体(兔抗)、 NF-κB抗体均由武汉博士德生物工程有限公司提供；722S型分光光度仪由上海仪电分析仪器有限公司制造等，多聚甲醛、二甲苯、乙醇等常规试剂由海南省海口市人民医院中心实验室提供。

按随机数字表法将45 只大鼠分为生理盐水对照组(normal sham，NS)、PQ模型组及二烯丙基硫化物(diallyl sulfide，DAS)治疗组，每组 15 只。一次性灌胃PQ溶液(70 mg/kg)制备中毒动物模型；NS组灌胃等量生理盐水。制模后当日分别经腹腔注射 100 mg/kg DAS(DAS 治疗组)、等量生理盐水(PQ组和NS组)，均每日 1 次，共 14 d。本实验动物处置方法符合动物伦理学标准。

各组分别于制模 3、7 和14d随机每组取 5 只大鼠，给予水合氯醛麻醉，然后解剖胸腔暴露肺，行支气管肺泡盥洗，收集灌洗液测定肺泡灌洗液中蛋白含量。分离培养肺泡巨噬细胞(alveolar maerophages，AM)，用细胞免疫化学方法检测AM中 NF-κB的表达情况。

采用SPSS 20.0统计软件进行统计分析，计量资料服从正态分布变量以均数±标准差(x±s)表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

采用差速贴壁的方法分离纯化AM，30 min可以见到较多的巨噬细胞贴壁(图 1)，通过换液将大量的未贴壁细胞换去，继续培养。获得纯度较高的贴壁细胞。采用倒置显微镜下观察生活状态、Wright’ s染色光镜观察。Giemsa染色证实贴壁细胞为巨噬细胞，纯度>90%。巨噬细胞结果判断：细胞核染成紫红色或蓝紫色，胞质染成粉红色。分离纯化30 min后的肺泡巨噬细胞，培养状况良好，形态家，呈圆形，胞质透亮，折光性良好。

A：PQ组贴壁巨噬细胞；B：DAS组贴壁巨噬细胞 图 1 大鼠巨噬细胞分离结果(×200) Fig 1 The primary cultured alveolar macrophages(×200)

图选项

对照组支气管肺灌洗液中有少量蛋白，并随时间进展逐渐升高，NS组和PQ组比较，支气管肺泡灌洗液中蛋白含量3 d、7 d、14 d差异均有统计学意义(均P<0.05)。PQ组和DAS组比较支气管肺泡灌洗液中蛋白含量3 d、7 d、14 d差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表 1。

AM免疫细胞化学NF-κB p65,蛋白阳性反应产物呈棕黄色。NS组可见少量散在的NF-κB p65阳性免疫反应产物，主要位于胞质中(图 2)。PQ组可见较多NF-κB p65阳性免疫反应产物，随着PQ刺激时间的不同而变化。 NF-κB p65阳性免疫反应产物主要位于细胞核中，表明NF-κB被激活;图 2为PQ处理7 d后，经过DAS治疗后的AM中NF-κB 的表达情况。 巨噬细胞分离纯化培养后，再行NF-κBp65蛋白免疫组织化学染色，观察p65定位变化。在NS组可见细胞胞质浅淡着色，提示p65定位于胞质(图 2A)。PQ组胞质着色加深，同时细胞核也出现阳性着色，提示NF-κB在百草枯诱导下，其激活的蛋白从胞质转移到胞核(图 2C)，阳性细胞数大量增加。DAS组胞核表达着色较浅(图 2B)。对7 d组AM通过Imagepro Media图像分析系统自动判定为细胞核NF-κB的阳性表达，分析积分吸光度和阳性染色面积积分，NS组与PQ组比较，t=6.4811，P<0.05。PQ组与其余两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，说明DAS能下调PQ诱导的急性肺损伤时NF-κB表达。

A:生理盐水组；B:二烯丙基硫化物组；C:百草枯组 图 2 7 d组肺泡巨噬细胞NF-B免疫细胞化学结果 Fig 2 The expression of NF-κB in alveolar macrophages by immunocytochemistry at 7 th day

图选项

百草枯是目前世界范围内最广泛使用的季胺类除草剂之一。自1962年PQ问世以来，百草枯中毒导致大量人员死亡，中毒主要的原因是误服或自杀服毒。一旦服毒，于12~24 h后百草枯迅速降解，重新分配到肺、心、肾、肝导致多器官功能衰竭危及生命^[6]，中毒机制与肺内聚胺类物质的摄取有关^[7]。目前研究表明，DAS具有下调AM中NF-κB的表达作用，其结果与Underwood等^[8]研究的结果一致。NF-κB首先由Seo和Baltimore^[9]于1956年在B细胞中发现。它广泛存在于真核细胞内，能与许多基因启动子区域的固定核苷酸序列结合而启动基因转录。NF-κB是由一组结构上相关的蛋白质家族组成，通常以p50和p65两个亚基组成的异二聚体的存在形式。静息状况下NF-κBp65亚基与κB抑制蛋白(inhibitor of kB，IκB)非共价键结合在一起存在于细胞质中^[10]。当细胞受到内毒素、细胞因子、氧自由基、病毒、蛋白等刺激后，IκB发生磷酸化进而泛素化和降解，于是受其抑制的NF-κB得以迅速从细胞质易位到细胞核，并与基因上κB位点发生特异性结合，从而促进有关基因的转录^[11]，NF-κB的过度激活可导致过度强烈的炎性反应，引起肺或其他脏器的急性损伤。近年研究发现，NF-κB是一种能与多种基因启动子或增强子部位κB位点发生特异性结合并促进其相关基因转录的蛋白质因子，参与调节ARDS时炎症因子基因的表达，与ARDS发生发展密切相关。换言之，NF-κB是炎性细胞因子表达的重要调控因子。具有强大的基因调控能力，在调控与ARDS有关的细胞因子、黏附分子及其他炎性介质的转录方面起着核心作用。PQ正是通过激活NF-κB，最终触发全身性炎性反应，从而导致ARDS。通常静止状态下，NF-κB与κB抑制蛋白(IκB)结合以二聚体无活性状态存在于胞质中。在一些因子(如百草枯等)的激活下，IκB蛋白磷酸化降解而与NF-κB解离，从而使激活的NF-κB进入核内诱导基因表达^[12]。另有资料证明NF-κB可以调节炎症基因的表达^{[13, 14, 15, 16]},并广泛涉及急性肺损伤炎症介质的调节，当有炎症反应刺激，NF-κB从胞质到达胞核，活化转录基因κB依懒基因，包括E-选择蛋白、细胞间黏附分子、血管细胞黏附分子-1等^[17]。从本实验可以看出，未用百草枯处理的巨噬细胞，可见胞质浅淡着色(即胞质阳性),提示P65定位与胞质；PQ处理后细胞核染色开始加深，即开始出现细胞核阳性，随着时间的延长阳性更加明显，这正与NF-κB活化过程吻合，说明PQ中毒大鼠有大量NF-κB被刺激活化，与IκB分离而有胞质进入细胞核进而参与下游炎症因子的转录和翻译，诱导炎症反应，造成肺损伤进一步加重，最终发展为纤维化。深入研究NF-κB及其调控的下游分子，将有助于揭示ARDS发病机制，探寻有效的防治措施。