急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)导致心室壁收缩运动不协调，收缩力降低，泵血功能障碍，继而引发心室整体结构和功能病理变化，即心室重构，最终发展为心力衰竭。防治AMI后心室重构可有效改善患者生存预后，降低病死率。线粒体在活细胞中不断动态重构，包括线粒体生物合成、自噬、融合/分裂等事件，协同调控线粒体稳态(mitochondrial homeostasis)，进而影响线粒体ATP和活性氧(ROS)的输出^[1]。研究表明，心肌细胞线粒体稳态异常导致能量供应障碍和氧化应激损伤是AMI后心肌收缩力减弱和心室重构的重要病理机制^[2]。

在心脏疾病的运动康复方案制定中，对运动强度的设计十分谨慎，大多采用中等强度持续运动训练(moderate-intensity continuous training，MCT)。笔者前期也证明，8周MCT可有效抑制大鼠AMI后心肌氧化应激，提高线粒体能量代谢水平，改善左心室泵功能^{[3, 4]}。但在临床康复实践中，MCT由于运动持续时间长且节奏单调，患者往往难以坚持。近年来，高强度间歇运动(high-intensity interval training，HIT)被证明是冠心病、心梗稳定期、心衰患者有效运动康复方案。HIT由多轮次高强度运动(接近最大运动能力)和低强度运动(间歇期)交替形成，主动休息的间歇期调节了高强度运动诱导的生理和心理应激，使HIT的愉悦性和坚持性均显著高于MCT^[5]。

Freyssin等^[6]发现，8周HIT使心衰患者最大摄氧量(VO_2max)提高了27%，而相同耗氧量的MCT却无显著提高。Rognmo等^[7]也发现，10周HIT使冠心病患者VO_2max提高了17.9%，而相同耗氧量的MCT仅提高7.9%。以上提示在干预心脏疾病中HIT较MCT更具时效性，但其生物学机制尚不清楚。本研究拟观察短周期(4周)HIT和MCT干预AMI后心室重构的效果差异，并探讨心肌线粒体稳态各组分在其间的变化规律，以期揭示HIT和MCT在心脏疾病康复中的潜在机制。

健康雄性Sprague-Dawley大鼠，体质量205~237 g，由军事医学科学院实验动物中心提供。自由进食水，每日光照12 h，饲养环境22~25 ℃。

RM-6240多导生理记录仪和小动物跑台购自成都仪器厂；Cary Eclipse荧光分光光度计购自美国UMAX公司；MIKRO 120垂直电泳仪购自德国Hettich公司。JC-1荧光染料、DCFH-DA荧光染料、荧光素酶购自美国Sigma公司；抗体均购自美国Abcam公司。

参照文献[4]，采用结扎左冠状动脉前降支诱导AMI大鼠模型。大鼠称质量后给予1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(40 mg/kg)，气管插管，连接小动物呼吸机，连接心电图肢体导联。左胸第3肋与第4肋间开胸，在左心耳根部和肺动脉圆锥左缘下1 mm处用无损伤缝合线(7-0)结扎左冠状动脉前降支，当肉眼观察结扎区变为紫色，同时心电监测显示QRS波升高并增宽，ST段弓背上抬超过0.2 mV，则为结扎成功。迅速将心脏回位，关闭胸腔，轻轻挤压胸腔以恢复胸腔负压，缝合胸壁。术后连续3 d给予青霉素15万 U/kg肌肉注射，预防感染。假手术大鼠开胸但不结扎冠状动脉，其余处理与AMI模型大鼠相同。

术后1周，AMI模型大鼠存活32只，假手术大鼠存活10只。将AMI模型大鼠随机(随机数字法)分为3组：AMI对照组(AMI，n=10)，AMI+HIT运动组(AMI+H，n=11)，AMI+MCT运动组(AMI+M，n=11)。假手术大鼠全部纳入假手术组(Sham，n=10)。AMI+H组大鼠进行高强度间歇运动训练，根据Bedford大鼠体质量/摄氧量回归方程确定跑台坡度和速度^[8]。大鼠在每次训练前后分别以60%VO_2max(5°，14 m/min)进行7 min的热身运动和2 min的冷却运动。高强度间歇运动训练方案为：以80% VO_2max(5°，21 m/min)快速跑4 min，间歇以40% VO_2max(5°，10 m/min)慢速跑3 min，重复7个循环，总运动时间为58 min，1次/d，5 d/周，共4周。AMI+M组大鼠进行中等强度持续运动训练，跑台训练负荷为60%VO_2max(5°，14 m/min)，运动时间为58 min，1次/d，5 d/周，共4周。两种运动模型的运动负荷被证明是一致的^[9]。术后5周，AMI组和AMI+H组大鼠各死亡1只，AMI+M组大鼠死亡2只，其余大鼠均进行指标检测并纳入统计。

末次运动训练后24 h，大鼠给予1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(40 mg/kg)，将连接RM-6240多导生理记录仪和压力换能器的塑料心导管插入切开的右颈总动脉，在向心脏方向插入进程中监测压力曲线，判断进入左心室后稳定10 min，记录左心室收缩压(LVSP)，左心室舒张末期压(LVEDP)、左心室压力上升/下降最大速率(±dp/dt max)。

心功能测定结束后，迅速开胸取出心脏，预冷生理盐水清洗，剔除非心肌组织。留取部分心肌-80 ℃冻存用于western-blot检测，剩余部分即时制备线粒体。参照笔者前期方法，采用差速离心法提取心肌线粒体^[10]。心肌组织剪碎、匀浆。加入提取介质(0.25 mol/L 蔗糖,3.0 mmol/L HEPES,0.5 mmol/L EDTA,pH 7.4)，800 r/min离心10 min，取上清液于10 000 r/min离心10 min。取沉淀悬浮于20 mL提取介质中，10 000 r/min离心10 min。取沉淀悬浮于1 mL提取介质中。线粒体蛋白定量用考马斯亮蓝法检测。

采用JC-1荧光探针标记法^[10]。将0.5 mg线粒体加入0.9 mL JC-1染色工作液，37 ℃避光水浴10 min。加入3 mmol/L苹果酸+8 mmol/L谷氨酸启动态4呼吸，荧光分光光度计测定红色荧光(激发波长525 nm，发射波长590 nm)和绿色荧光(激发波长490 nm，发射波长530 nm)。计算红色荧光数值/绿色荧光数值表示为线粒体膜电位。

采用荧光素-荧光素酶发光法^[10]。在反应介质(0.5 mmol/L EDTA，3.0 mmol/L HEPES,0.25 mol/L蔗糖，0.1 mmol/L苹果酸，1 mmol/L谷氨酸)中加顺序加入0.05 mg线粒体和20 μmol/L荧光素酶，记录该体系发光强度作为本底，继而加入4 μmol/L ADP启动反应，荧光分光光度计记录发光强度。

采用二氯荧光素标记法^[10]，将线粒体悬液加入测定介质(1 mmol/L EDTA，10 mmol/L Hepes，1.5 mg 脱脂BSA，130 mmol/L KCl，2.5 mmol/L KH₂PO₄，pH 7.4)，稳定后加入0.1 mmol/L苹果酸+1 mmol/L谷氨酸启动态4呼吸，最后加入5 μmol/L DCFH-DA，避光37 ℃水浴15 min。荧光分光光度计连续测定荧光强度3 min(激发波长488 nm，发射波长525 nm)。

Western-blot法检测心肌PINK1、Beclin1、Mfn2、Drp1、Tfam、COXⅣ和PGC-1α蛋白表达量，β-tubulin为内参。在垂直电泳仪上用10 μg蛋白质样品经12% SDS-PAGE分离后，转移致PVDF膜上。一抗4 ℃静置孵育过夜，洗涤3次，再以1∶ 1 000辣根过氧化物酶标记的对应二抗室温孵育1 h，充分洗涤后，使用ECL试剂盒发光显影，X线胶片压片曝光，扫描定量各条带的相对灰度值。以Sham组条带灰度值为100%，AMI、AMI+M和AMI+H组条带灰度值与Sham组的比值，即为其相对表达量(%)。

实验所得各组数据均采用均数±标准差(x±s)表示，使用SPSS 13.0统计软件，采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

与Sham组比较，AMI、AMI+M和AMI+H组LVSP和±dp/dt max绝对值均显著降低(P<0.05或P<0.01)，LVEDP显著升高(P<0.05或P<0.01)。与AMI组比较，AMI+H组LVEDP显著降低(P<0.05)，±dp/dt max绝对值显著升高(P<0.05)。与AMI+M组比较，AMI+H组±dp/dt max绝对值显著升高(P<0.05)，见表 1。

与Sham组比较，AMI、AMI+M和AMI+H组膜电位和ATP合成活力显著升高(P<0.05或P<0.01)，AMI组ROS生成速率显著降低(P<0.01)。与AMI组比较，AMI+H组膜电位和ATP合成活力显著升高(P<0.05)，AMI+M和AMI+H组ROS生成速率显著降低(P<0.01)，见表 2。

与Sham组比较，AMI、AMI+M和AMI+H组PINK1和Beclin1表达显著升高(P<0.05或P<0.01)。与AMI组比较，AMI+M和AMI+H组PINK1和Beclin1表达显著升高(P<0.05)，见图 1。

与Sham组比较,aP<0.05, bP<0.01；AMI+M、AMI+H与AMI组比较,cP<0.05 图 1 不同运动方式对AMI大鼠心肌线粒体自噬的影响 Fig 1 Effect of different types of exercise on mitochondrial autophagy in AMI rats

图选项

与Sham组比较，AMI组Mfn2表达显著降低(P<0.01)，Drp1表达显著升高(P<0.01)，AMI+M和AMI+H组Mfn2和Drp1表达均显著升高(P<0.05)。与AMI组比较，AMI+M和AMI+H组Mfn2表达显著升高(P<0.05)，Drp1表达显著降低(P<0.05)，见图 2。

与Sham组比较,aP<0.05, bP<0.01；AMI+M、AMI+H与AMI组比较,cP<0.05，dP<0.01 图 2 不同运动方式对AMI大鼠心肌线粒体融合/分裂的影响 Fig 2 Effect of different types of exercise on mitochondrial fusion/fission in AMI rats

图选项

与Sham组比较，AMI和AMI+M组Tfam、COXⅣ和PGC-1α表达均显著降低(P<0.05或P<0.01)。与AMI组比较，AMI+M组PGC-1α表达显著升高(P<0.05)，AMI+H组Tfam、COXⅣ和PGC-1α表达均显著升高(P<0.05或P<0.01)。与AMI+M组比较，AMI+H组Tfam、COXⅣ和PGC-1α表达均显著升高(P<0.05)，见图 3。

与Sham组比较，aP<0.05, bP<0.01；AMI+M、AMI+H与AMI组比较，cP<0.05，dP<0.01；AMI+H与AMI+M组比较,eP<0.05 图 3 不同运动方式对AMI大鼠心肌线粒体生物合成的影响 Fig 3 Effect of different types of exercise on mitochondrial biogenesis in AMI rats

图选项

本研究旨在探讨在AMI后心室重构中HIT与MCT干预的时效性差异及相关机制，因而选用4周这个较短的训练周期。Holloway等^[9]在高血压致心衰大鼠中发现，4周HIT明显降低心肌细胞横截面积，而对左心室纤维化水平无明显改善；相反，4周MCT对心肌细胞横截面积无显著影响，但使左心室纤维化水平降低了40%。提示HIT在心肌重构层面较MCT更具时效性。本研究中，4周HIT显著提高±dp/dt max的绝对值，而MCT虽有提高趋势但无统计学差异。±dp/dt max在一定程度反映了左心室心肌收缩力，上述结果表明短周期MCT尚不足以改善AMI后心室泵功能，而HIT在干预AMI后心室功能重构方面更具时效性。

作为持续舒缩的横纹肌，心肌功能更依赖于线粒体稳态。AMI后心室重构中心肌处于缺血、缺氧状态，线粒体是损伤的重要靶位，表现为能量代谢障碍、氧化应激及凋亡通路启动等^[11]。本研究中，HIT和MCT均显著抑制AMI大鼠心肌线粒体ROS生成，但仅有HIT显著提高了膜电位及ATP合成活力。Tocchetti等^[12]利用高糖孵育H9c2心肌细胞并进行时程观察，发现9 h线粒体抗氧化酶MnSOD活性即升高，而48 h线粒体ATP合成酶活性才开始恢复。提示心肌线粒体优先选择处理氧化应激压力。笔者前期也发现，短周期MCT仅可上调心肌线粒体抗氧化能力，而长周期MCT在增加ROS清除能力同时还可提高线粒体ATP合成酶活性^[10]。结合本研究表明，4周MCT可抑制AMI心肌氧化应激，但尚不足以提高能量代谢，而HIT促进线粒体力能学重构的时效性更优于MCT。

线粒体损伤严重无法修复时，线粒体自噬(mitochondrial autophagy)启动以清除异常线粒体，是细胞的一种自我保护机制。本研究中，AMI大鼠心肌线粒体自噬显著升高，表现为PINK1和Beclin1表达显著升高。PINK1是受损线粒体识别者和线粒体自噬启动者，Beclin1是调控自噬体形成的关键因子。研究表明，与野生型小鼠比较，PINK1^[13]和Beclin1^[14]基因缺陷小鼠在结扎冠状动脉后，心功能障碍和异常线粒体堆积更为明显，心肌梗死面积更大。以上表明，AMI上调心肌线粒体自噬进行自我保护，但不足以清除损伤线粒体。本研究中，HIT和MCT进一步上调PINK1和Beclin1表达。本研究在低氧暴露模型中也发现，阻断线粒体自噬抑制了运动对骨骼肌功能及线粒体稳态的促进效应^[15]。提示线粒体自噬是实现运动健康效应的途径之一。笔者发现，一次性跑台运动即可激活大鼠心肌线粒体自噬，并持续至运动后48 h^[16]。表明心肌线粒体自噬对运动较敏感，这可能是HIT和MCT上调线粒体自噬时效性未表现显著差异的原因之一。

细胞中线粒体并非独立存在，而是通过不断融合(fusion)和分裂(fission)维持线粒体网络空间构象，利于线粒体发挥功能。本研究中，AMI导致线粒体融合/分裂失衡，表现为融合蛋白Mfn2表达降低，而分裂蛋白Drp1表达升高。Chen等^[17]利用H₂O₂孵育H9c2心肌细胞，发现Mfn2表达降低，而Drp1表达升高。提示，AMI诱导的氧化应激破坏了心肌线粒体融合/分裂平衡。本研究还发现，HIT和MCT均显著上调AMI心肌Mfn2表达，甚至高于假手术大鼠。研究表明，过表达Mfn2可提高离体心肌细胞对缺血的抵抗力，抑制ROS生成及线粒体渗透性转换孔开放^[18]。因而运动上调Mfn2是一种心肌保护机制。此外，两种运动方式均明显抑制Drp1表达，但仍显著高于假手术大鼠。线粒体过度分裂可通过释放细胞色素C激活线粒体凋亡途径，但适度分裂是自噬启动的基础^[19]。Troncoso等^[20]发现，Drp1特异性抑制剂Mdivi-1抑制了L6成肌细胞线粒体自噬，导致受损线粒体积累。笔者推测，HIT和MCT维持相对高水平线粒体分裂与上调线粒体自噬相关，并通过上调线粒体融合使线粒体网络形成新的平衡。

细胞能量供应由单位线粒体功能和线粒体数量共同决定，且数量变化是稳定能量重构的决定因素，即线粒体生物合成(mitochondrial biogenesis)。过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1(PGC-1α)是线粒体生物合成主控因子。本研究发现AMI后5周，心肌PGC-1α及其下游靶基因线粒体转录因子A(Tfam)蛋白表达明显降低，线粒体呼吸链标志蛋白COXⅣ表达亦显著降低。研究表明，AMI后急性期心肌PGC-1α表达应激性升高，慢性期PGC-1α表达降低，伴随线粒体数量减少和心肌供能障碍^[21]。本研究中，HIT和MCT均上调AMI大鼠心肌PGC-1α表达，但HIT组上调幅度显著高于MCT组。此外，Tfam和COXⅣ表达仅在HIT组有显著上调。PGC-1α除了调控线粒体生物合成，还参与调控Mfn2和PINK1表达^[22]。笔者推测，4周MCT小幅上调PGC-1α，仅参与促进线粒体融合和自噬，而HIT相对高幅度上调PGC-1α，调控了更有决定意义的线粒体生物合成。不同水平PGC-1α在调控线粒体稳态组分时是否存在剂量差异需要细胞实验进一步验证。

总之，HIT在干预AMI后心室重塑及线粒体稳态方面较MCT更具时效性。短周期MCT和HIT均可抑制线粒体氧化应激，并上调线粒体融合和自噬。此外，HIT参与调控线粒体能量代谢和生物合成，提高了线粒体质量和数量，而MCT未见此干预效果，这可能是仅有HIT提高左心室泵功能的机制之一。HIT与MCT在调控线粒体稳态组分的差异可能与其上调PGC-1α幅度差异有关。