在全球范围内，创伤导致的中青年致死、致残已成为严重的公共卫生问题^{[1, 2, 3]}，而在创伤死亡患者中因出血所致者高达40%^[4]。严重出血的创伤患者通常表现为“致死三联征”——创伤性凝血病(trauma-induced coagulopathy,TIC)、低体温以及酸中毒^[5]。创伤性凝血病病因复杂，组织损伤、休克、血液稀释、低体温，酸中毒和炎症反应均与其密切相关。创伤救治中输液导致的血液稀释是引发创伤凝血病的关键因素之一，血液稀释会导致凝血因子的稀释，降低凝血功能，同样低体温和酸中毒均会导致凝血因子活性降低以及血小板功能的抑制^[6]。目前治疗创伤性凝血病主要采用损伤控制性复苏策略(damage control resuscitation，DCR)，尽早使用血液和血液制品作为主要复苏液体，减少晶体液使用，防止继发的稀释性凝血病发生^{[7, 8, 9]}。笔者前期在临床研究发现采用复方氨基酸联用维生素B6疗法对于救治创伤性凝血病具有较好效果，是一种简便、有效，经济的新疗法^[10]。尽管该疗法在临床应用上取得了较好效果，但其具体作用机制仍未十分清楚。本文即从已建立的TIC动物模型出发，对该新疗法对肝脏凝血因子基因表达的影响及作用规律进行了初步的研究。

仪器包括ABI 7500 实时荧光定量PCR(美国Life Technologies公司)、高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)、分光光度计(上海美谱达仪器公司)、Mupid-One核酸电泳系统(日本Takara公司)、Gel-Doc凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)，WZS-50F2微量注射泵(浙江浙大医学仪器有限公司)。试剂包括维生素B6注射液2 mL (0.1 g/支，石药集团欧意药业有限公司)、20AA复方氨基酸注射液(丰诺安)(500 mL，南京辰欣药业股份有限公司)、复方氯化钠注射液(0.9%等渗盐水，四川科伦药业股份有限公司)、ReverTra Ace qPCR RT Kit(日本TOYOBO公司)、TRIzol Reagent(美国Life Technologies公司)，SYBR Select Master Mix Q-PCR kit (美国Life Technologies公司)，PCR引物合成(上海捷瑞生物工程有限公司)。

选择雄性SD大鼠30只，体质量170~200 g，江苏大学实验动物中心提供[SCXK(苏)2013-0011]。模型制作完毕后，大鼠分为正常组、假手术组、新疗法组、对照组；新疗法组与对照组又分为伤后4 h、6 h、12 h及24 h四个时间点组。新疗法组混合输注丰诺安10 mL+维生素B6 4 mL(相当于人体剂量：丰诺安500 mL+维生素B6 10 g);对照组输注0.9%等渗盐水 14 mL;假手术组大鼠备皮消毒后行颈静脉插管;正常组仅进行麻醉操作。

大鼠适应性喂食3 d，禁食8 h，禁水2 h，称质量后用新鲜配置的100 g/L水合氯醛(4 mL/kg)腹腔注射麻醉。麻醉后将大鼠固定于立体定向仪上，头部备皮消毒后剪开头皮，剥离骨膜，麻花钻于矢状缝右侧2 mm，冠状缝后4 mm处钻直径5 mm的圆形窗，硬脑膜保持完整。使用自由落体打击器用40 g砝码于25 cm处落下造成重度损伤，打击力1 000 g·cm，完成后缝合头皮。同时取双下肢股外侧切口切开皮肤及皮下组织，沿股外侧肌间隔钝性分离，暴露股骨干，于股骨中段用组织剪横行剪断，止血后缝合皮肤。随后仰卧位固定大鼠，躯体左右对称，消毒后沿腹中线自耻骨上至胸骨下剪开皮肤与腹膜，将腹壁翻向左右两侧，充分暴露腹腔，自左向右轻推移肠管，显露出腹后壁，清除腹膜后脂肪组织，穿刺点为左右髂动脉分叉处向心端1～3 mm处，抽取动脉血量约为大鼠总血容量的20％，压迫止血后将肠管归位，缝合腹膜及皮肤。

模型制作完成后，大鼠仰卧位固定，颈部切开，钝性分离结缔组织和肌肉，暴露颈静脉，分离并插入PE-50管，固管缝合伤口后，连接微量输液泵，输液速度为4 mL/h。

提取RNA所用的耗材均为无RNA酶制品，玻璃器皿常规洗净后，180 ℃烘烤6 h。所有试剂均用0.1%DEPC水配制。样品匀浆化处理：剪切新鲜肝脏组织后迅速液氮冷冻保存，提取总RNA时取50~100 mg组织块，加入1 mL TRIzol，玻璃匀浆管研磨，室温静置5 min后，匀浆液4 ℃，12 000 g离心10 min后取上清液；加入0.2 mL氯仿，剧烈震荡15 s，室温放置3 min；4 ℃，12 000 g离心15 min后取上层水相，加入0.5 mL异丙醇，室温放置10 min；4 ℃，12 000 g离心10 min后，移去上清液，加入1 mL 75 %乙醇洗涤RNA沉淀；4 ℃，7 600 g离心5 min,移去上清液。空气中干燥RNA沉淀10 min；加入50 μL 0.1%DEPC水，55 ℃放置10 min溶解RNA。RNA纯度检测及定量：取适量RNA稀释后，分光光度计测定A₂₆₀和A₂₈₀，计算RNA浓度，琼脂糖电泳鉴定其完整性。

RNA的反转录：按ReverTra Ace qPCR RT kit说明书体系进行反转录，合成cDNA；定量PCR反应： 使用SYBR Select Master Mix进行Real-time PCR，反应在ABI 7500上进行。qPCR引物设计采用NCBI提供的Primer-BLAST工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)，引物序列见表 1，反应条件为50 ℃ 2 min；95 ℃ 2 min；(95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s)，40个循环。为确定扩增特异性，PCR产物均进行溶解曲线分析并进行琼脂糖凝胶电泳。mRNA的表达水平利用2^-ΔΔCt进行计算，利用管家基因GAPDH进行标准化。

应用SPSS 13.0进行统计分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，多组间比较采用多因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

采用琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA的完整性及纯度，结果见图 1。电泳结果显示明显的5 s、18 s和28 s条带，且28 s条带的亮度大约是18 s条带的两倍，说明提取的总RNA基本没有降解。紫外分光光度计对RNA样品进行分析的结果显示A₂₆₀/A₂₈₀比值在1.8~1.9之间，表明RNA具有较高纯度，满足反转录合成cDNA的要求。

M：DNA相对分子质量标准品；1：正常组；2：假手术组；3：新疗法组；4：对照组 图 1 肝脏组织总RNA电泳结果 Fig 1 Total RNA extracted from liver tissue

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为验证凝血因子基因在肝脏中的表达情况，笔者利用正常大鼠的肝脏cDNA作为模板，检测7条在肝脏中合成的凝血因子基因的表达，结果如图 2所示。所有引物对均能检测到预期长度的PCR产物，没有非特异扩增条带的出现。溶解曲线分析的结果也是单一峰图，与PCR产物电泳结果一致(结果未显示)。说明所设计的PCR引物能够用于凝血因子基因的定量检测，且所有7条基因均在肝脏细胞中正常表达。

M：DNA相对分子质量标准品；1：F Ⅱ；2：F Ⅶ；3：FⅨ；4：F Ⅹ；5：F Ⅺ；6：F Ⅻ；7：F Ⅷ；8：GAPDH 图 2 凝血因子基因定量PCR扩增结果 Fig 2 Real-time PCR products of coagulation genes

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采用定量PCR对所有处理组的凝血因子基因mRNA表达水平进行了检测，结果显示(图 3)创伤后大鼠的凝血因子基因mRNA表达明显上调，其中伤后 4 h表达上调倍率最大，随后随时间延长，表达水平出现逐渐下降的趋势。同时发现不同凝血因子基因在伤后表达变化存在差异，FⅨ上调倍率最高，伤后4 h新疗法组与对照组分别为(12.752±3.617)和(5.208±0.184)；而FⅪ上调倍率最低，伤后4 h新疗法组与对照组分别为(1.332±0.582)和(0.869±0.174)。

A~G分别为凝血因子FⅡ，FⅦ，FⅨ，FⅩ，FⅪ，FⅫ，FⅩⅢA亚基; 与对照组比较，aP<0.05 图 3 凝血因子基因mRNA相对表达变化 Fig 3 The change of mRNA expression of coagulation genes

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对新疗法组与对照组的凝血因子基因mRNA表达变化进行比较后发现，在本研究检测的7个凝血因子基因中，凝血因子F Ⅱ，F Ⅹ与F Ⅻ在伤后4 h至24 h所有时间点，新疗法组均高于对照组，其差异具有统计学意义(P<0.05)；而凝血因子F Ⅶ与F Ⅸ在伤后4 h至12 h，新疗法组显著高于对照组(P<0.05)，而在伤后24 h，新疗法组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)；凝血因子F XIII A亚基在伤后4 h，新疗法组显著高于对照组(P<0.05)，而伤后6 h至24 h，新疗法组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)；凝血因子FⅪ在伤后4 h至24 h，新疗法组与对照组均差异无统计学意义(P>0.05)。

创伤性凝血病是创伤救治过程中的常见并发症，其发病机制复杂，受多种因素影响。笔者前期在临床上发现复合氨基酸联用维生素B6疗法能够救治创伤凝血病导致的大出血患者，目前已在常州地区开展多中心前瞻性临床研究^[11]。复合氨基酸(丰诺安注射液)是由20种氨基酸配制而成，主要用于预防和治疗肝性脑病，具有改善肝功能，提高机体营养状况的作用。而维生素B6是氨基酸代谢的重要辅酶，参与了转氨基、脱羧、侧链裂解、脱水及转硫化作用等多种代谢反应，影响肝脏蛋白质合成与分解代谢^[12]。而血液凝固是一系列复杂的级联酶促反应过程，需要多种凝血因子的参与。目前已发现的凝血因子主要有14种，其中根据发现的先后顺序用罗马数字编号命名的有12种，为凝血因子Ⅰ~ⅩⅢ。这些凝血因子除FⅣ是Ca²⁺外，其余均为蛋白质，且大多数在肝脏内合成，因此肝脏是影响凝血功能的重要器官^[13]。

本课题组之前的工作表明，通过颅脑损伤、双股骨骨折，开腹及腹主动脉放血等手段所制成的大鼠多发伤模型能够出现凝血功能异常，血栓弹力图实验证明该模型在伤后4~6 h出现高凝状态，之后凝血功能持续下降，24 h与正常组比较差异具有统计学意义^[14]，而张娟娟等^[15]利用猪创伤失血休克模型也发现在创伤早期存在一过性高凝状态，随后转变为低凝状态。这些模型结果与临床上急性创伤凝血病表现较为吻合。因此，笔者在已建立的大鼠创伤凝血病模型基础上证明了复合氨基酸联用维生素B6疗法能够显著恢复模型大鼠的凝血因子活性，并缩短纤维蛋白凝块形成的时间，改善模型大鼠的凝血功能^[16]，但新疗法的具体作用机制仍未完全清楚。在本研究中，笔者发现7个在肝脏中合成的凝血因子基因，除F Ⅺ与FⅩⅢA外，其余基因均在模型致伤后4 出现不同程度的mRNA表达水平上调，随后其表达水平逐渐下降，该结果与之前所观察到的大鼠模型先出现高凝状态，后凝血功能持续降低的现象一致。而采用复合氨基酸联用维生素B6疗法的处理组，其凝血因子基因mRNA表达上调水平显著高于对照组(P<0.05)，其表达水平虽然随伤后时间延长而降低，但仍维持在较高的水平。该结果提示复合氨基酸联用维生素B6疗法能够刺激大鼠模型凝血因子基因的表达，促进凝血因子在肝脏中的合成，补充因创伤失血导致的凝血因子损失。因此该疗法能够迅速恢复内源性凝血途径，通过配合常规治疗，从而有效地治疗创伤凝血病患者。