创伤失血性休克(hemorrhagic-traumatic shock，HTS)是重症监护病房常见的疾病，在创伤失血性休克的过程中伴有程序性坏死的产生^[1]。程序性坏死是一种在细胞凋亡被阻断时由相应配体激活死亡结构域(death domain，DD)而启动的受体相互作用蛋白3(receptor-interacting protein 3，RIPK3)依赖的、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)非依赖的可调控性细胞坏死，是由Degterev等^[2]提出并命名的，他们的研究同时筛选出一种能特异性抑制程序性坏死的小分子物质，即程序性坏死特异性抑制剂-1(necrostatin-1，Nec-1)。程序性坏死可以导致细胞膜通透性增高，并释放出细胞内容物和暴露出损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)^[3]。高迁移率族蛋白(high mobility group protein，HMG)是脓毒症晚期的重要炎性介质^{[4, 5]}，是典型的DAMPs之一。所以，笔者设想，在创伤失血性休克的过程中，程序性坏死可以促进炎性介质HMGB-1的释放，并加速创伤失血性休克后MODS的产生。本实验旨在探讨HMGB-1在创伤失血性休克中的表达及相关机制，并进一步探究Necrostatin-1对HMGB-1表达的影响，为临床治疗提供新的方法。

Nec-1购自美国Sigma-Aldrich公司，DMSO(二甲基亚砜)购自美国Amresco公司，HMGB-1酶联免疫分析试剂盒(ELISA)购自上海拜沃生物科技有限公司。兔抗大鼠HMGB-1单克隆抗体购自英国Abcam公司，胞质蛋白提取试剂盒和总蛋白提取试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠96只，体质量(250±20)g，购自军事医学科学院实验动物中心，许可证号SCXK-(军)2009-003。所用动物在无菌恒温(25±1)℃，湿度(55±1)%动物房饲养，并接受12 h交替光照射并自由饮食，大鼠实验前禁食12 h、自由饮水。96只大鼠按随机数字表法分为3组，假手术组、DMSO对照组、Nec-1实验组，每组各32只。所有实验中使用的动物、试剂及处理方法都符合实验动物伦理标准，并通过天津市第一中心医院动物实验伦理委员会的批准。

动物称质量后，麻醉，大鼠固定恒温(37 ℃)手术台上，用夹钳钳断大鼠左下肢股骨及胫骨横行骨折，造成骨折创伤，再用手术剪于腹中线切开一个约5 cm长切口，然后再分离肌层，深度到露出腹腔脏器后用湿纱布覆盖，造成软组织损伤。再将颈部沿气管中线切开，钝性分离颈部肌肉、分离左侧颈动脉，颈动脉远端用4号丝线结扎，近端用动脉夹夹住，剪一小口，将麻醉用硬膜外管插入并固定，连接多导生理监护仪，连续监测BP、MBP、HR、R。后剪开右下肢皮肤，分离出股静脉，插入静脉留置针，与注射器相连，并固定。记录实验前BP、MBP、HR、R。从股静脉放血MBP至30 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，再使MBP维持在30~40 mmHg之间90 min(必要时放血或回输液体)。90 min后将放出的血加2倍的林格液匀速回输给动物，回输时间30 min，复苏完后记录BP、MBP、HR、R。撤管后缝合关腹。

假手术组：仅进行麻醉、分离血管、结扎血管，并不进行创伤失血和再灌注。DMSO组：建立创伤失血性休克大鼠模型，DMSO按体质量(kg)×0.2 mL给药，再灌注前5 min股静脉给药。Nec-1组：建立大鼠创伤失血性休克模型，25 mg Nec-1 溶于2.5 mL DMSO中，于再灌注前5 min股静脉给药，1 mg/kg。每组又根据时间点分为4个亚组(2 h、8 h、16 h、24 h)。每个亚组各8只大鼠。

液体复苏后,分别在2 h、8 h、16 h、24 h各处死8只大鼠，腹主动脉取血5 mL，室温静置2 h后，离心机3 000 r/min离心15 min，血清置于-80 ℃保存。取部分肝脏组织置于10%甲醛保存。取部分肝脏组织置于冻存管，-80 ℃保存。

采用全自动生化分析仪检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平。

常规梯度酒精脱水，石蜡包埋肝组织，切片，行HE染色，光镜下观察肝组织病理变化。

利用透射电镜观察再灌注后24 h后细胞器水平的细胞坏死。

通过酶联免疫分析法(ELISA)分析血清中HMGB-1含量。

用蛋白质免疫印迹法(western blotting)分别检测肝组织中细胞胞质蛋白和细胞总蛋白中HMGB-1的表达，分别利用胞质蛋白提取试剂盒和总蛋白提取试剂盒提取胞质蛋白和总蛋白，取20 μg蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电转至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭液中37 ℃ 封闭1 h；加入一抗HMGB-1 4 ℃过夜。反复洗PVDF膜后，将PVDF膜与二抗共孵育，室温轻摇1.5 h，洗膜后，ECL法显影定影，以GAPDH作为对照，比较各组灰度值。

采用SPSS 20.0统计软件处理数据，计量资料用均数±标准差(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组件两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

ALT、AST结果见表 1、表 2。与假手术组比较，DMSO组和Nec-1组肝功能指标呈明显升高趋势，假手术变化不明显。假手术组、DMSO组和Nec1组2 h血清ALT、AST差异无统计学意义(P＞0.05)。DMSO组和Nec-1组比较，再灌注后8 h、16 h、24 h大鼠肝功能差异有统计学意义，Nec-1组的肝功能指标明显下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

肝脏HE染色见图 1，a1、a2、a3、a4分别表示假手术组2 h、8 h、16 h、24 h的大鼠肝脏的病理切片，可见肝窦结构完整，无炎细胞浸润。b1、b2、b3、b4分别表示DMSO组再灌注后2 h、8 h、16 h、24 h的肝脏病理切片，可见随再灌注时间的延长，肝细胞逐渐气泡样变，肝窦结构逐渐破坏，血管结构破坏殆尽，炎细胞浸润明显。c1、c2、c3、c4分别表示Nec-1组2 h、8 h、16 h、24 h的肝脏病理切片，图中可见随再灌注后的时间的延长，肝细胞逐渐肿胀，肝窦结构逐渐被破坏，肝条索稀疏，炎细胞浸润。但与DMSO组比较，损伤程度明显减轻，炎细胞浸润也不明显。

图 1 光镜观察下不同时间点各组大鼠肝脏的病理变化(HE×200) Fig 1 Pathological changes of the liver in different groups at different intervals(HE×200)

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假手术组(图 2A)细胞膜结构完整，胞质内线粒体密集丰富，形态良好，线粒体嵴丰富整齐，内质网发达，溶酶体少见，染色质丰富细颗粒状。DMSO组(图 2B)细胞膜结构尚可，胞质内线粒体数量溶解、嵴消失、减少、变性，内质网数量减少，溶酶体增多，脂滴增多，染色质出现粗颗粒。Nec-1组(图 2C)线粒体数量较模型组增多，部分溶解变性，嵴减少，内质网数量较模型组增多，溶酶体数量较少，未见明确脂滴，染色质细颗粒状。

A：假手术组；B：DMSO组；C：Nec-1组 图 2 透射电镜扫描下再灌注后24 h各组大鼠肝脏的形态变化 Fig 2 Microphotographs scanned by transmission electron microscope showing morphology changes in the hepatocyte at 24 h following reperfusion

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表 3可见，随再灌注后时间的延长，DMSO组和Nec-1组中，血清HMGB-1蛋白在2 h左右开始升高，并在16 h时达到高峰，并随后逐渐下降。Nec-1组中血清HMGB-1的含量在16 h、24 h时比DMSO组有明显的下降，其差异具有统计学意义(P＜0.01)。

胞质蛋白HMGB-1含量可见图 3，胞质中HMGB-1在2 h时开始升高，在16 h达到高峰，并持续到24 h之后。假手术组可见HMGB-1没有明显升高。Nec-1组胞质HMGB-1的含量在8 h、16 h、24 h时有明显下降，差异具有统计学意义(P＜0.01)。总蛋白中HMGB-1结果可见图 4，图中可见，与假手术组比较，DMSO组和Nec-1组中HMGB-1含量有显著增高(P＜0.05)，但随时间增长的趋势并不明显。与DMSO组比较，Nec-1组在8 h、24 h总蛋白HMGB-1含量有明显下降(P＜0.05)。

与假手术组比较，aP＞0.05，bP＜0.05；与DMSO组比较，cP＜0.01 图 3 各组间肝脏细胞胞质HMGB-1蛋白表达的比较 Fig 3 The comparison of HMGB-1 in hepatocellular cytoplasm at different intervals between groups

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与假手术组比较，aP＜0.05；与DMSO组比较，bP＜0.05，cP＞0.05 图 4 各组间肝脏细胞总HMGB-1蛋白表达的比较 Fig 4 The comparison of HMGB-1 in hepatocellular total protein at different intervals between groups

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创伤失血性休克的大鼠肝脏在再灌注之后，伴有程序性坏死的发生^[1]。程序性坏死是依赖RIP3的可调控的坏死过程^[6]，发生程序性坏死的细胞膜失去完整性，细胞内容物的释放使坏死细胞具有引起炎症反应的能力。这些能产生免疫反应的内容物命名为DAMPs^[7]。所以，DAMPs的释放在程序性坏死致疾病进展过程中发挥着重要作用。HMGB-1属于非组蛋白核蛋白^[8]，属于典型的DAMPs，其受体晚期糖基化终末产物受体(the receptor for advanced glycation end products,RAGE)可以通过激活NF-κB通路刺激细胞分泌趋化因子及细胞因子^{[9, 10]}，加速炎症的进展。所以，研究HMGB-1与程序性坏死的关系可以进一步揭示程序性坏死破坏细胞的分子机制，意义重大。

本研究结果显示：用程序性坏死特异性抑制剂Nec-1对大鼠进行干预后，肝脏中发生程序性坏死的细胞数量和程度均降低，Nec-1组的病理结果及电镜结果可以看到明显的改善，肝功能指标也有明显改善。检测HMGB-1之后，可见胞质及血清中HMGB-1的含量有显著下降。

本研究对HMGB-1的研究主要在两个方面：HMGB-1释放的时间及释放的机制。在早期的研究中，证明HMGB-1是脓毒症的晚期炎性介质^{[4, 11]}。目前的众多研究提示，HMGB-1可能作为急性炎症的“启动程序”^[12]，并在一些急性炎症中，扮演早期炎性介质的角色^{[13, 14, 15]}。本研究显示，在大鼠创伤失血性休克模型中，肝脏再灌注后2 h，肝细胞胞质HMGB-1就开始分泌增多，并随着时间的延长而持续升高，并在16 h时达到高峰，持续到24 h。说明HMGB-1在创伤失血性休克模型早期就开始释放，并持续较长时间。关于其与疾病严重程度的关系，Peltz等^[15]的研究提示血清HMGB-1的含量与机械创伤的患者的预后没有关系，本研究的结果也没有提示血清HMGB-1的含量与疾病严重程度的绝对关系，但仍需继续探索。

关于HMGB-1的释放机制，笔者进行了初步的探索，分别检测了肝组织中胞质蛋白和总蛋白的HMGB-1的含量，结果显示，胞质中HMGB-1的含量随再灌注后的时间增长而增长，到16 h时达到高峰，而总蛋白的含量与假手术组比较略有升高，与再灌注时间而增长的趋势不明显，说明在损伤的肝细胞中，细胞同时进行生成HMGB-1和核中HMGB-1向胞质转移来释放HMGB-1，并以核内蛋白向胞质转移为主。Nec-1组与DMSO组比较，Necrostatin-1对细胞总蛋白中HMGB-1影响并不明显，说明Necrostatin-1对细胞生成HMGB-1无显著影响，胞质蛋白的检测结果显示，Necrostatin-1对HMGB-1从核内向胞质转移的影响较为显著。其机制如下，凋亡的细胞核中HMGB-1和残存的核内容物结合很紧密，而坏死的细胞则会释放出大量的HMGB-1^[16]。HMGB-1的释放主要以坏死的细胞为主，坏死细胞的HMGB-1的释放又主要以细胞破裂后核中HMGB-1大量溢出为主。所以，Necrostatin-1通过特异性抑制程序性坏死，可以有效地减少HMGB-1从细胞核向胞质的释放，而保护肝脏。

综上所述，在大鼠创伤失血性休克的疾病进展过程中，Necrostatin-1可以有效减少肝脏程序性坏死的产生，减少坏死细胞中HMGB-1的释放，有效保护肝脏。为目前临床治疗创伤失血性休克提供新的治疗思路。