中华急诊医学杂志  2016, Vol. 25 Issue (4): 455-459
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左艳芳, 宋凤卿, 陈蒙华, 甘伟妮. WIN55, 212-2在心肺复苏后对神经细胞凋亡的作用[J]. 中华急诊医学杂志, 2016, 25(4): 455-459.
Zuo Yanfang, Song Fengqing, Chen Menghua, Gan Weini. The effect of win55, 212-2 on neuronal apoptosis in post-resuscitation in rats[J]. Chin J Emerg Med, 2016, 25(4): 455-459.
WIN55, 212-2在心肺复苏后对神经细胞凋亡的作用
左艳芳, 宋凤卿, 陈蒙华, 甘伟妮    
530027 南宁，广西医科大学第一附属医院西院ICU
收稿日期：2015-12-03
基金项目：国家自然科学基金(81460289，81201447)；广西自然科学基金(2012GxNsFBA053086，2013GXNSFAA019189)
通信作者：宋凤卿，Email: f_q_song@hotmail.com
摘要：目的 探讨WIN55，212-2药物性低温在心肺复苏后对神经细胞凋亡的作用。 方法 健康SD大鼠经食道直流电刺激建立心脏骤停模型。成功诱导后5 min行心肺复苏，恢复自主循环的大鼠存活30 min后，随机(随机数字法)分为3组(n=10/组)：WIN55, 212-2组(W组, WIN55, 212-2，1 mg/(kg·h)、常温对照组：等体积的5%DMSO+37 ℃(NT组)、WIN55, 212-2+37 ℃组(W+NT组， WIN55, 212-2，1 mg/(kg·h)；用药时间维持4 h后，WIN55，212-2组复温2 h达37 ℃，观察ROSC后3组大鼠72h内的存活情况及神经功能评分。相同方法再次建立上述3组动物模型，分别于24 h、48 h、72 h在各组中随机选取5只大鼠，通过HE染色法观察脑组织形态学变化以及通过 TUMEL法观察脑组织海马CA1区神经元细胞凋亡情况。 结果 W组大鼠的体温在4 h内逐渐由37℃降到34 ℃。W组大鼠的累积生存率明显高于W+NT组及NT组 (P=0.02)。W组大鼠的神经功能评分较W+NT组和NT组明显改善(P<0.05)。W组大鼠神经细胞病理损伤以及神经细胞凋亡情况较其余两组少。W+NT组大鼠的病理损伤及凋亡情况介于两者之间。 结论 212-2在心肺复苏后诱导大鼠低温，延长存活时间，改善神经系统功能。其作用可能与WIN55, 212-2减轻脑组织病理损伤、减少神经细胞凋亡有关。
关键词： 心肺复苏     WIN55, 212-2     药物性低温     凋亡    
The effect of win55, 212-2 on neuronal apoptosis in post-resuscitation in rats
Zuo Yanfang, Song Fengqing , Chen Menghua, Gan Weini     
The West Branch of Intensive Care Unit, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530027, China
Fund Program: National Natural Science Foundation of China (81460289, 81201447) ;Guangxi Natural Science Foundation (2012GxNsFBA053086，2013GXNSFAA019189)
Corresponding author: Song Fengqing,Email: f_q_song@hotmail.com
Abstract: Objective To investigate the pharmacological hypothermic effect of WIN55, 212-2 on neuronal apoptosis after cardiopulmonary resuscitation. Methods Cardiac Arrest (CA) was induced in Sprague-Dawley rats. Five minutes after onset of CA, cardiopulmonary resuscitation (CPR) was carried out. At 30 minutes post-resuscitation, the animals were randomized into three groups (n=10 in each group): (1) WIN55,212-2 hypothermia group [W group，WIN55, 212-2，1 mg/(kg·h)]. (2) Normothermia group (NT group, 5% DMSO); (3) WIN55,212-2 with normothermia group (W+NT group, WIN55,212-2, 1 mg/(kg·h). Animals in WIN55,212-2 hypothermia group and WIN55,212-2 with normothermia group were dealt with continuous intravenous infusion of WIN55,212-2[1 mg/(kg·h)] for 4 h, while rats in NT group were infused with equal volume of 5% DMSO instead. The survival time and neurological deficit score (NDS) were observed. The CA models were established in three groups. After rats were sacrificed, the brains were harvested for detecting histopathological changes and apoptosis of neural cell at 24 h, 48hand 72hafter ROSC respectively. Five animals of each group were chosen randomly(random number). Results Body temperatures of rats inWgroup decreased from 37°C to 34°C in 4 hours. Accumulated survival rate inWgroup was higher than that in the other two groups (P=0.02). NDS was significantly improved inWgroup than that in the other two groups (P<0.05). Morphological change inWgroup was less serious than that in the other two groups. The number of neuron apoptosis inWgroup was smaller than that in the other two groups. Conclusions WIN55,212-2 inducing pharmacologically hypothermia during post-resuscitation prolonged survival and improved cerebral function in rat cardiac arrest models. The beneficial effects of WIN55,212-2 were associated with ameliorating the histopathological damage in brain and alleviating the neuron apoptosis.
Key words: Cardiopulmonary resuscitation     WIN55,212-2     Pharmacological hypothermia     Apoptosis    

心肺复苏(cardiopulmonary resuscitation,CPR)后尽早给予亚低温治疗已成为改善心脏骤停(cardiac arrest,CA)患者预后的一个重要治疗手段[1]。但目前对低温的诱导方式及持续时间仍存在争论[2, 3, 4, 5]。近年来有研究采用药物性低温应用于心肺复苏中，但国内研究者甚少，且其作用机制目前国内外尚未见有文献报道。本研究采用经食道心脏快速起搏诱导大鼠心脏骤停，复苏后给予大麻素受体激动剂WIN55,212-2诱导大鼠低温，同时用物理方法阻断其低温效应，观察该药物对大鼠的疗效以及其对神经细胞凋亡的作用。

1 材料与方法 1.1 动物分组

健康SD大鼠(动物来源：广州中医药大学实验动物中心)，体质量200～220 g，雌雄不限，随机(随机数字法)分为WIN55,212-2组(W组,WIN55,212-2，1 mg/(kg·h)、常温对照组(NT组，等体积的5% DMSO+37 ℃)、WIN55,212-2+37 ℃组(W+NT组，WIN55,212-2，1 mg/(kg·h)。每组10只观察自主循环恢复时间(restoration of spontaneous circulation,ROSC)及存活时间。并分别在复苏24 h、48 h及72 h进行神经功能评分[6]。另外，再选取复苏成功的45只大鼠，随机(随机数字法)分成以上三组，每组大鼠分别在24 h、48 h、72 h各取5只脑组织待测，若大鼠未到检测点死亡，补充够实验例数。

1.2 动物准备

3组大鼠均经腹腔注射戊巴比妥钠(sigma，45 mg/kg)麻醉，经口气管内插入14 G气管套管备接呼吸机。分离左侧股动静脉，各置入l条PE50充满5 U/mL肝素钠生理盐水留置管。股动脉留置管通过压力换能器与BL-420F生物机能实验系统(四川，成都泰盟仪器公司)相连，监测有创动脉压，股静脉留置管用于给药。四肢经皮下针头记录标准Ⅱ导联心电图。通过食道放置测温仪监测大鼠体温。

1.3 心脏骤停与心肺复苏

采用课题组建立的经食道直流电刺激建立大鼠心脏骤停型[7]，刺激开始5 min时开始常规CPR。采用ALV-V9型动物呼吸机(上海奥尔科特生物科技有限公司)行机械通气(室内空气)，通气频率70次/min，潮气量为6 mL/kg；用自制的按压器进行胸外心脏按压，频率200次/min。按压深度为大鼠胸廓前后径1/3。按压1 min时静脉给予肾上腺素0.02 mg/kg，如10 min内未恢复自主循环者放弃复苏。ROSC的大鼠连续监测心电、血压及体温6 h。随后终止机械通气、拔除气管导管和动脉、静脉导管并结扎止血，检查无活动性出血后将动物放入笼内，观察动物的呼吸及一般情况变化，直至自主呼吸停止，期间不使用任何药物。记录大鼠ROSC至72 h内生存时间。所有大鼠在死亡后常规进行尸检，肉眼观察内脏器官和大血管有无发生与血管穿刺或胸外心脏按压相关的并发症。

1.4 用药方案

复苏成功的大鼠在自主循环恢复后30 min分别给予1 mg/(kg·h) 的WIN55,212-2(sigma，W组及W+NT组)，等体积的5% DMSO (sigma，NT组)，药物维持共4 h后WIN55,212-2组大鼠给予缓慢复温2 h达(37.0±0.2) ℃。

1.5 温度控制

通过预实验，室温维持在25 ℃，以加热灯放置离动物一定距离时整个实验过程可保持NT组大鼠体温恒定在(37.0±0.2) ℃；W组在相同条件下同时给予药物，温度变化为药物作用所致；W+NT组在给予药物同时通过加热灯对抗药物低温，仍保持动物体温维持在(37.0±0.2) ℃。

1.6 判定标准

在快速心室起搏时出现动脉搏动波消失伴有血压下降者定义为CA，当停止心脏起搏时心电图可表现为室颤、或无脉性电活动、或一条直线(全心停搏)[8]；判断自主循环恢复(restoration of spontaneous circulation,ROSC)的标准为出现室上性节律(包括窦性，房性或交界性心律)伴有平均动脉压>20 mmHg，持续1 min以上[9] 。

1.7 HE染色方法

取大鼠左半侧大脑半球，脑组织在4％甲醛溶液固定24 h后，常规石蜡包埋，4 μm切片，切片常规用二甲苯脱蜡，经各级酒精至水洗，苏木精染色10 min，自来水冲洗，伊红伊液复染30 s。而后自来水浸泡冲洗3 min。吸干水后常规脱水，封片。

1.8 神经细胞凋亡的检测

取大鼠左半侧大脑半球，脑组织在4％甲醛溶液固定24 h后，常规石蜡包埋，4 μm切片，按照过氧化物酶标记的原位细胞凋亡检测试剂盒(Roche)说明书行大鼠海马神经元Tunel检测。每组大鼠取5张切片，100倍显微镜(Olympus，CX41)下观察海马CA1神经元的形态，胞核成深棕色的细胞即为凋亡细胞。400倍下随机选取海马CA1区不重叠的3个视野，随机选取视野下的100个神经元细胞，计算3个视野下每100个细胞中凋亡细胞平均数，以“个/高倍镜视野”为单位。

1.9 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，计量资料的比较用方差分析，两两比较方差齐采用LSD-t检验，方差不齐采用Dunnett T3比较。累积生存率的比较用Breslow检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 基础参数比较

实验前各组大鼠体质量、收缩压、舒张压、平均动脉压、心率、体温差异无统计学意义(P>0.05)。ROSC时间差异无统计学意义(P>0.05)，见表 1。

表 1 三组大鼠基础参数比较 Table 1 Comparison of variables at baseline among three groups
(x±s)
组别例数(只)收缩压(mmHg)舒张压(mmHg)平均压(mmHg)心率(次/min)温度(℃)ROSC时间(s)
NT组10144±7115±4126±6431±1736.87±0.10188±61
W组10148±7114±4126±7444±2736.85±0.00165±49
W+NT组10147±6112±6124±7449±2736.90±0.00179±89
表选项
2.2 存活时间及神经系统评分

W组累积生存率明显长于NT组和W+NT组(P＝0.02)。W组72 h内的神经系统评分明显优于NT组和W+NT组，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见图 1、表 2。

与NT组及W+NT组比较，aP=0.02 图 1 三组大鼠生存曲线比较 Fig 1 Comparison of survival among three groups
图选项
表 2 各组大鼠ROSC后神经系统评分比较 Table 2 Comparison of neurological deficit score among three groups
(x±s)
组别例数24hNDS评分48hNDS评分72hNDS评分
NT组10269.6±135.3375.3±167.4410.0±152.4
W组10196.7±60.7135.0±202.4ab153.5±239.1ab
W+NT组10249.2±89.6381.6±140.0353.6±197.47
注：与W+NT组比较，aP<0.05, 与NT组比较，bP<0.05
表选项
2.3 三组体温变化比较

W组大鼠体温可逐渐下降至34 ℃。见图 2。

BL: 基线; PR: 复苏后 图 2 三组大鼠体温变化图 Fig 2 Temperature changes of three groups
图选项
2.4 HE染色结果

光镜下，变性的神经元呈紫红色，NT组大鼠海马CA1区的神经元变性严重，数目明显增多，核染色质浓缩、深染，锥体细胞外形皱缩，细胞排列紊乱，细胞与微血管周围间隙普遍增宽，组织间质水肿，部分神经细胞和胶质细胞显著肿胀、变圆，24～72 h变化过程中，变性的神经元数目增多，细胞排列更紊乱。W组与NT组相比，大鼠海马CA1区神经元排列紧密整齐，变性的神经元数目减少，CA1区看到零落的变性的神经元，细胞轻微水肿，24～72 h变化过程中，细胞排列整齐，变性的神经元数目有增多趋势，W+NT组与NT组相比，细胞排列大致整齐，但整齐性较W组差，海马CA1区可见散落的变性的神经元，核染色质浓缩、深染，锥体细胞外形皱缩，细胞排列紊乱，24～72 h变化过程中，细胞排列整齐差，变性的神经元数目增多。见图 3。

图 3 HE染色下各组大鼠海马区CA1区细胞的形态学变化(HE×400) Fig 3 The CA1 region of the hippocampus of rats and the morphology of cells (HE×400)
图选项
2.5 三组神经细胞凋亡情况比较

W组细胞凋亡明显少于其余两组(P<0.05)。W+NT组大鼠的神经细胞凋亡介于NT组与W组之间，与NT组差异无统计学意义(见表 3、图 4)。

表 3 海马CA1区神经细胞中凋亡的细胞数目(个) Table 3 Apoptotic neurons in hippocampus CA1 among three groups(Number)
组别24 h48 h72 h
NT组35±1156±1073±23
W组10±2ab13±5 b 16±5 ab
W+NT组34±1033±1748±13
注：与W+NT组比较，aP<0.05, 与NT组比较，bP<0.05
表选项
图 4 Tunel染色下各组大鼠海马区CA1区细胞的凋亡情况( Tunel×400) Fig 4 CA1 regions of the hippocampus of rats and the apoptosis among three groups( Tunel×400)
图选项
3 讨论

心肺复苏后对昏迷患者尽早给予亚低温治疗可显著改善预后。目前诱导低温的方法有表面冰袋、冰毯物理降温、经静脉冰冻输液等[2, 3, 4, 5]，但这些方法均是通过刺激外周温度感受器，反射到体温中枢来调节体温，达到目标温度速度慢，效果欠佳。

大麻素类物质具有止痛、镇静、抗痉挛、抗呕吐、抗青光眼及抗高血压以及控制体质量等药理作用[10]。大麻素类物质包括两类：内源性大麻素类物质和外源性大麻素类物质，在外源性大麻素类物质中，(四氢大麻酚9-THC)是第一个被发现的大麻药物，随后又采用化学方法合成了许多大麻衍生物CP55940，HU210及WIN55,212-2等。其中WIN55,212-2是一种非选择性大麻素受体激动剂。近年来，有报道显示该药物可通过下丘脑视前区(POAH)的大麻素受体系统直接诱导低温，且温度下降的程度与WIN55,212-2的剂量成正相关，降温峰值发生在使用WIN55,212-2后的60～180 min之间[11]。Sun等[12]采用经右心室内膜诱导大鼠心室颤动8 min行心肺复苏后给予WIN55,212-2共6 h，发现WIN55,212-2组大鼠的体温持续下降到34℃左右，且存活时间显著延长。Ma等[13]报道在心肺复苏中如果抑制WIN55,212-2的低温效应，则可逆转其疗效。因此，考虑WIN55,212-2在心肺复苏中的疗效均是低温所致。本研究结果显示：WIN55,212-2在复苏后可诱导大鼠低温从而延长存活时间，改善神经系统功能。而拮抗其低温效应后存活时间显著缩短。WIN55,212-2的这种神经系统保护作用机制目前尚未见有文献报道。本研究首次发现，与其他两组比较，WIN55,212-2组大鼠在复苏后各时间点脑组织的病理损伤明显减轻，同时还发现WIN55,212-2组大鼠神经细胞的凋亡明显减少。表明WIN55,212-2在心肺复苏后改善神经系统功能是通过减轻神经细胞病理损伤、减少神经细胞凋亡实现的。

本研究发现虽然与对照组比较差异无统计学意义，但WIN55,212-2常温组大鼠的生存时间相对延长，而且病理组织损伤以及凋亡也介于三组之间。WIN55,212-2为大麻素受体激动剂，考虑其保护神经功能的机制可能不仅限于低温。Fernandez-Lopez等[14]在7 d的乳鼠缺氧模型中发现WIN55,212-2可减轻炎症反应，而应用CB1受体抑制剂后炎症因子TNF-α表达增多。Bonfils等[15]采用大脑中动脉栓塞法制作局部脑缺血模型，研究显示WIN55,212-2低温组以及WIN55,212-2常温组脑梗死体积均显著少于对照组[(2.84±1.16) mm3、(6.84±1.98) mm3 vs(12.43±1.75)mm3，P<0.1]。本研究WIN55,212-2常温组的作用可能与其相似。但其作用相对低温的保护作用来说比较微弱，考虑可能与部分减轻炎症反应有关，具体机制还有待于进一步研究。

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