230601合肥,安徽医科大学第二附属医院麻醉科(何淑芳、金世云、胡军、张野)
Department of Anesthesiology, Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230601, China ( He SF, Jin SY, Hu J, Zhang Y)
心力衰竭是各种心脏疾病发展的终末阶段,随着人口老龄化,心力衰竭的发病率和病死率逐年上升[1]。心力衰竭病理生理机制研究已发展到分子水平,多种基因参与心力衰竭的发生发展[2]。microRNA (miRNA) 是一类单链小分子非编码RNA,特异度识别靶基因3’非翻译区的互补片段(3’UTR),通过在转录后水平负性调控基因的表达[3],在各类心血管疾病的发生发展中发挥重要作用[4],因此,作为重要的基因表达调控因子,miRNA在心力衰竭过程中的作用受到广泛关注。本研究拟观察阿霉素致大鼠心力衰竭模型心肌细胞miRNA表达谱的变化,并应用生物信息学分析软件预测差异表达miRNA的靶基因及其功能,为进一步明确心力衰竭的发生机制提供参考。
1 材料与方法 1.1 主要试剂及仪器盐酸阿霉素(Pfizer,意大利),M199培养基 (Hyclone,美国),Trizol (Invitrogen,美国),新生牛血清(杭州四季青,中国),ITS、BDM、BSA(Sigma,美国),Vivid 7.0彩色超声仪(GE,美国),缺氧小室(Stem Cell,加拿大),Chip ID Rat Sanger miRBase V19.0 miRNA微阵列芯片(LC Sciences,美国),GenePix 4000B激光扫描仪(Molecular Device,美国),Mx3000P TM Real Time PCR 扩增仪(Agilent,美国),All-in-One TM miRNA qRT-PCR Detection Kit(广州复能基因,中国)。
1.2 动物分组及模型制备成年雄性SD大鼠,200~220 g,江苏大学实验动物中心提供 [合格证批号:SCXK (苏) 2009-0002],随机(数字法)分为两组:心衰模型组(HF组)和正常对照组(CON组)。HF组参照文献[5]的方法制备大鼠慢性心力衰竭模型,每周尾静脉注射阿霉素2 mg/kg,连续6周;CON组注射等量生理盐水。于8周末采用Vivid 7.0彩色超声仪测量左心室射血分数(LVEF)和左心室短轴缩短率(LVFS),以评价大鼠心功能。参照文献[6]采用Langendorff逆行灌注法分离大鼠心室肌细胞,杆状率>90%的细胞用于进一步实验研究,细胞在含ITS、BDM、BSA的M199培养基中培养过夜。
1.3 心肌细胞miRNA表达检测 1.3.1 miRNA表达谱芯片检测分离成功的心肌细胞培养过夜后采用Trizol试剂提取总RNA,紫外分光光度计和非变性凝胶电泳鉴定RNA的质量和浓度,每组留取4只大鼠心肌细胞的RNA样本。鉴定合格的RNA送联川生物技术公司行miRNA表达谱芯片检测,芯片采用大鼠miRNA V Chip 19.0版本(包含722个成熟大鼠miRNA)。miRNA的表达水平为5次生物学重复的平均值,采用Student’ s -test法比较CON组与HF组差异表达的miRNA,筛选标准为:荧光信号强度>500,P<0.01,假阳性率(false discovery rate,FDR)<0.05。
1.3.2 荧光定量RT-PCR验证芯片结果随机选取两组大鼠(n=4)分离心室肌细胞并提取总RNA,运用Mx3000P TM Real Time PCR 扩增仪行荧光定量RT-PCR检测,对芯片结果进行验证。
1.4 差异miRNA靶基因预测及功能显著性分析运用miRNA TargetScan、miRanda分析软件对芯片 检测差异性表达的miRNA进行靶基因的预测,选择两种软件交集的靶基因。基于GO(Gene ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes)数据库,运用DAVID软件进行GO和Pathway显著性分析。计算P值,并根据P值排序计算FDR值,数据采用Fisher 精确检验和χ2检验进行统计,以P<0.01且FDR<0.05 认为差异具有统计学意义[7]。
1.5 统计学方法采用SPSS 10.0统计软件进行分析,正态分布的计量资料以均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用配对设计资料的t检验分析,以P﹤0.05认为差异具有统计学意义。生物信息学数据分析采用 Fisher 精确检验和χ2检验进行统计。
2 结果 2.1 差异表达的miRNA及qRT-PCR验证芯片结果显示,共检测出37个差异表达的miRNA,其中22个miRNA上调,15个miRNA下调(P<0.01且FDR<0.05)。上调的miRNA中,荧光信号值>500的有:miR-6216、let-7e-5p、miR-352、miR-29b-3p、miR-30d-5p;下调的miRNA中,荧光信号值>500的有: miR-133b-5p、miR-6215、miR-181a-5p、miR-378a-3p、miR-378b、miR-22-3p、rno-miR-24-3p,见表 1。
(x±s, n=4) | |||||||
上调miRNA | t值 | P值 | Fold change(HF/CON) | 下调miRNA | t值 | P值 | Fold change(HF/CON) |
miR-6216 | 9.96 | <0.01 | 5.31 | miR-133b-5p | 19.41 | <0.01 | 0.02 |
let-7e-5p | 6.80 | 0.0005 | 3.39 | miR-6215 | 13.56 | <0.01 | 0.67 |
miR-352 | 11.80 | 0.0013 | 1.62 | miR-181a-5p | 9.07 | 0.0001 | 0.61 |
miR-29b-3p | 5.433 | 0.0016 | 1.44 | miR-378a-3p | 7.68 | 0.0003 | 0.69 |
miR-30d-5p | 3.938 | 0.0076 | 1.15 | miR-378b | 6.84 | 0.0005 | 0.71 |
miR-22-3p | 12.56 | <0.01 | 0.71 | ||||
rno-miR-24-3p | 12.42 | <0.01 | 0.78 | ||||
注:miR: miRNA,Fold change: 差异倍数 |
对芯片结果中变化最为显著的miRNA(荧光信号值>500,P<0.01,Fold change>2)行qRT-PCR验证,结果表明HF组miR-133b-5p [(0.053 6±0.006 8) vs. (0.004 2±0.000 3),t=14.56,P<0.01]表达显著下调,miR-6216 [(0.000 2±0.000 1) vs. (0.001 3±0.000 2),t=9.32,P<0.01]和let-7e-5p [(0.062 5±0.008 6) vs. (0.161 4±0.011 3),t=13.92,P<0.01]表达显著上调,变化趋势与芯片结果一致。
2.2 差异表达miRNA 靶基因显著富集的 GO和Pathway靶基因 GO 显著性分析显示,HF组差异表达miRNA的靶基因主要富集于31个GO。其中12个GO被上调miRNA的靶基因调控,富集度最高的GO主要涉及泛素-蛋白酶体系统(GO:0006511、GO:0008234、GO:0070936);19个GO被下调miRNA的靶基因调控,主要涉及G蛋白相关激酶激活(GO:0007189)、钠离子转运(GO:0006814)及MAPK激酶激活(GO:0000186)等,P<0.01,见图 1。
Pathway 显著性分析显示,靶基因显著富集于12条信号通路,主要包括丝裂原活化蛋白激酶通路(MAPK signaling pathway)、Toll样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)、细胞代谢(glycine serine and threonine metabolism)等,见图 2。
3 讨论心力衰竭是一种心功能进行性下降和循环衰竭的临床综合征,高血压、冠心病、风湿性心脏病等病理信号使心肌细胞发生肥厚、纤维化、凋亡,同时标志性基因表达亦发生改变[8],导致心肌收缩力下降、心脏扩大,最终出现心力衰竭。研究表明阿霉素使心肌细胞膜脂质过氧化、破坏线粒体结构、诱导细胞凋亡,最终导致心力衰竭[9],阿霉素尾静脉注射制作大鼠心力衰竭模型操作方便,贴近临床心力衰竭病理生理[10]。本实验参考文献[5]方法制备大鼠心力衰竭模型,结果表明,与CON组比较,HF组大鼠心功能、心质量/体质量、心质量/肺质量指数均显著减低,与文献报道基本一致,提示模型制备成功。参照文献[6]方法分离大鼠心室肌细胞,心衰细胞获得率约为正常心肌细胞的60%。
miRNA是一类小分子单链非编码RNA,通过互补结合靶基因3’UTR片段,抑制其翻译,在转录后水平调控靶基因的表达[3]。研究显示miRNA控制人类近30%的基因表达,调控各种心血管疾病过程,如心肌缺血再灌注损伤、凋亡、纤维化[4]。miRNA芯片分析技术是一种新型、高通量、高效率的miRNA表达谱检测方法,具有较高的特异度和敏感度,本实验所用V Chip19.0版本大鼠miRNA表达谱芯片共包含722个成熟大鼠miRNA,细胞及RNA提取、芯片杂交技术及生物学重复等过程均严格质控,以确保芯片检测结果的稳定性和重复性。芯片筛选出心衰细胞中差异表达的miRNA 37个,经荧光定量RT-PCR验证显示,HF组与CON组比较,miR-133b-5p表达显著下调,miR-6216和let-7e-5p表达显著上调,其变化趋势与芯片结果一致,提示芯片结果可信。研究表明,miR-133b在人扩张性及缺血性心衰心肌组织中表达下调,过表达miR-133b抑制心肌细胞肥厚相关基因的表达,提示miR-133b有调控肥厚性心肌病的作用[11]。心肌细胞凋亡是心力衰竭发生机制之一[8],研究人员发现miR-133b在胚胎心肌组织中表达下调,通过靶向抑制caspase cleaved-CK18发挥抗凋亡作用[12]。本实验结果显示miR-133b-5p在心衰细胞中显著下调,提示其在心衰发展过程中可能发挥重要作用,但其靶基因及功能尚需进一步深入研究。HF组表达上调的miRNA中,let-7e在梗死后心肌组织中表达下调,过表达let-7e可靶向抑制β1-肾上腺素受体表达发挥抗梗死后心律失常的作用[13]。miR-6216为本研究中发现的新的miRNA,其功能目前尚未见文献报道。
为进一步探索差异表达miRNA的功能,本研究利用Targetscan、miRanda软件预测差异表达miRNA 可能调控的靶基因,并对这些靶基因运用DAVID软件行生物信息学分析。我们同时选择两种软件预测,选取交集的靶基因,以避免单一软件预测的假阳性,提高了分析的准确度。结果显示,这些靶基因功能及信号通路主要涉及泛素蛋白酶体系统、MAPK信号通路、Toll样受体通路。泛素蛋白酶体系统是蛋白质降解的重要途径之一,通过调控凋亡抑制蛋白(IAPs)[14]、核因子κB(NF-κB)[15]介导细胞凋亡及炎症反应。阿霉素通过诱导心肌细胞凋亡致心衰,研究显示热休克蛋白HSP10和HSP60可通过抑制BCL-xl的泛素化降解、增加BCL-xl表达,从而抵抗阿霉素诱导凋亡的作用[16]。P38MAPK活化可诱导心肌细胞凋亡[17]及心肌肥厚[18],在心力衰竭进展中发挥重要作用。Toll样受体信号通路(Toll-like receptor sigaling,TLRS)是哺乳动物固有免疫的重要组成部分,最近研究显示,TLRs活化介导的内在免疫反应激活在梗死后心肌重塑中发挥重要作用。
综上所述,本研究利用miRNA芯片技术发现miRNA在阿霉素性心力衰竭细胞中表达谱发生显著改变,其中miR-133b-5p、miR-6216、let-7e-5p值得关注。通过生物信息学分析预测分析miRNA调控的靶基因及其功能,为进一步探索心力衰竭发生机制提供新的切入点,但对差异miRNA靶基因及其功能的验证尚需进一步探索。
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