100048 北京,解放军总医院第一附属医院创伤研究中心(李俊聪、吴瑶、董宁、姚咏明)
Trauma Research Center, First Hospital Affiliated to the Chinese PLA General Hospital, Beijing 100048, China(Li JC, Wu Y, Dong N,Yao YM)
脓毒症是严重危害人类健康的临床综合征,其难治性及高病死率一直是急危重症学科的重点和难点[1]。脓毒症所致器官损伤主要表现为出现时间早、受累脏器多、干预措施少等特点。有研究证明,脑组织在脓毒症发生后数小时即出现不同程度的损伤,患者表现为感觉及定向障碍,严重脓毒症时患者出现明显的意识障碍,甚至昏迷[2]。动物实验发现部分脓毒症脑损伤可持续数周甚至几个月之久,造成永久性的神经功能障碍如认知功能和记忆功能的障碍[3, 4]。
高迁移率族蛋白B1(HMGB1)是重要的晚期炎症介质,在脓毒症的发生,发展过程中发挥着重要的作用。新近资料提示,HMGB1是脑损伤的重要机制之一,它能诱导多种促炎因子包括TNF-α、IL-1β及IL-6的释放并能活化小胶质细胞,增加局部炎症反应而加重脑损伤,导致神经功能障碍[4, 5]。目前,对于HMGB1介导脓毒症脑损伤的机制还未充分了解,对于脓毒症过程中脑组织HMGB1表达及与脑组织损伤的关系亦鲜有报道。本研究采用盲肠结扎穿孔(CLP)所致脓毒症模型,通过侧脑室直接注射HMGB1抑制剂(BoxA)对中枢HMGB1进行干预,深入探讨脓毒症过程中中枢HMGB1的表达变化及其与脓毒症脑损伤的关系,为有效防治脓毒症脑损伤开辟新途径。
1 材料与方法 1.1 实验动物清洁级C57BL/6雄性小鼠40只,购自北京华阜康生物科技股份有限公司,体质量(22±2)g,自由进食水,昼夜节律为12 h,环境湿度维持在50%左右。
1.2 主要材料与试剂实验所用试剂包括小鼠BoxA(IBL公司,德国)、兔抗小鼠HMGB1多克隆抗体(Abcam公司,美国)、兔抗小鼠caspase-3多克隆抗体(Cell Signaling Technology公司,美国)、Tunel凋亡检测试剂盒(Roche公司,德国)、兔抗鼠β-actin单克隆抗体(Santa cruz公司,美国)、FITC标记羊抗兔二抗(Cell Signaling Technology公司,美国)、异氟烷(鲁南贝特制药有限公司,中国)等。盖玻片、粘附型载玻片、山羊血清、苏木精-伊红染料均购自北京中衫金桥生物技术有限公司,辣根过氧化物酶偶联羊抗兔二抗及羊抗鼠二抗、ECL显影液、BCA蛋白定量试剂盒、预染蛋白Marker均购自北京普利莱基因技术有限公司。
1.3 实验方法 1.3.1 小鼠侧脑室置管模型制备及侧脑室微量注射小鼠适应性饲养3~4 d,自由进食水。采用异氟烷气体持续型吸入麻醉机对小鼠进行麻醉,全自动小鼠脑立体定位仪(NeuroStar公司,德国)对小鼠侧脑室进行精确定位。常规消毒,备皮,在头皮正中做一长度约1 cm的纵行切口,切开骨膜并充分暴露前囟点。识别并设定前囟点为坐标零点,在坐标点:X=-0.34 mm,Y=1 mm,Z=0 mm处做标记,用牙科钻在标记点钻一直径约1 mm的孔,将夹有小鼠侧脑室导管的夹持器定位于前囟点零点,输入坐标:X=-0.34 mm,Y=1.0 mm,Z=2.0 mm,此时导管进入侧脑室,用现配的牙科水泥进行固定,待牙科水泥凝固后升起夹持器。清理创口,缝合皮肤,再次消毒皮肤及导管帽。侧脑室微量注射:侧脑室置管后,小鼠适应性饲养5~7 d,进行小鼠侧脑室微量注射,左手固定住小鼠头部,碘伏棉签消毒导管周围皮肤及导管帽,取下导管帽,插入内芯导管,启动微量注射泵(5 μL/min),注射完成后停留1 min防止倒流,再次消毒导管外口,盖上导管帽,假伤组注射等体积无菌生理盐水。
1.3.2 脓毒症模型制备小鼠适应性饲养3 d后,行盲肠结扎穿孔术构建脓毒症模型,术前禁食12 h,自由饮水。编号,称重并随机分成4组:假伤组、脓毒症组、侧脑室注射假伤组以及脓毒症加中枢HMGB1拮抗剂组。腹腔注射2%水合氯醛对小鼠进行麻醉(15 mL/kg)。麻醉成功后,将小鼠固定消毒,沿腹正中线作约1.0 cm的纵行切口,逐层切开皮肤,肌层及腹膜,暴露盲肠。于盲肠根部至末端1/2处使用3号线结扎盲肠,用22G穿刺针贯穿盲肠一次并挤出少许肠内容物。将盲肠还纳腹腔,逐层缝合腹部切口,立即颈后皮下注射1 mL 0.9%生理盐水补液,术后自由进食饮水。假伤组仅开腹暴露盲肠后还纳、关腹,中枢注射HMGB1拮抗剂(0.2 μg/μL)于脓毒症术后立即给予1 μg HMGB1拮抗剂BoxA。
1.3.3 脑组织取材及苏木精-伊红染色(HE染色)假伤组及实验组小鼠于术后或脓毒症24 h麻醉,脱颈处死并立即取出完整的脑组织并分离出海马,将海马组织于4%多聚甲醛中4 ℃固定24 h,行逐级乙醇脱水、浸蜡及石蜡包埋处理,将脑组织连续冠状切5 μm厚薄片并行HE染色,光镜下观察海马组织形态学改变。
1.3.4 免疫荧光检测脑组织HMGB1表达取已包埋好的海马组织石蜡样本,连续冠状面切5 μm薄片行HMGB1免疫荧光染色。将切片脱蜡、脱水、抗原修复处理,0.3%Triton室温孵育15 min,山羊血清室温封闭2 h,4 ℃孵育HMGB1一抗(1∶ 500)过夜,PBS润洗3次后将切片在FITC标记羊抗兔二抗(1∶ 200)中室温孵育2 h,润洗后加抗荧光淬灭封片剂封片,荧光显微镜(Olympus公司,日本)观察HMGB1表达情况,Image-Pro Plus 6.0图片分析软件对组织荧光表达强度进行分析。
1.3.5 Tunel染色检测脑组织神经元凋亡经石蜡包埋处理好的脑组织样本,连续冠状面切片(厚度:5 μm)行TUNEL染色。采用Tris-HCL加3%BSA及20%正常牛血清混合溶液15~25℃浸泡切片30 min,PBS溶液润洗切片2次,待干,在切片上滴加50 μL TUNEL反应混合试剂(酶反应溶液与标记溶液的混合),阴性对照只加50 μL标记溶液,37 ℃孵育1 h,PBS溶液润洗3遍后,在荧光显微镜上观察组织细胞凋亡情况。
1.3.6 免疫荧光检测脑组织caspase-3表达情况取经脱水及石蜡包埋处理好的海马组织切片,连续冠状面切片(5 μm)行caspase-3免疫荧光染色。山羊血清封闭(室温2 h),4℃孵育兔抗小鼠caspase-3一抗(1∶ 200)过夜,PBS润洗后室温孵育FITC标记羊抗兔二抗(1∶ 200)2 h,PBS润洗3次后,在荧光显微镜下观察脑组织caspase-3表达情况。
1.3.7 蛋白印迹(Western blot)检测脑组织HMGB1表达各组小鼠脑组织取出后立即分离出海马,称重,匀浆,采用BCA法对蛋白浓度进行定量分析。通过聚丙烯酰氨凝胶电泳的方法分离目的蛋白,并采取半干转的方法将蛋白转移到硝酸纤维膜上,将膜置于10%脱脂牛奶中室温封闭2 h,HMGB1一抗(1∶ 1 000)4℃孵育过夜,TBS-T润洗3遍,每次5 min,辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗(1∶ 5 000)室温孵育1 h,TBS-T润洗3遍,在凝胶成像仪中(GE,美国)通过ECL显影试剂盒将膜显影、成像。采用Image Lab软件比较各条带灰度值的相对大小。
1.4 统计学方法采用SPSS19.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,两组结果比较采取成组t检验,组间差异采取单因素方差分析。当P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 脑组织HMGB1表达情况组织免疫荧光结果显示:海马部位脑组织HMGB1表达在脓毒症组较假伤组明显强[(22.74±9.29) vs. (4.57±2.18),P<0.05],见图 1(绿色荧光显示)。如图 2所示,Western blot分析发现脓毒症组海马HMGB1表达显著高于假伤组[(0.75±0.14) vs. (0.45±0.13),P<0.05]。
2.2 脑组织形态学改变组织HE染色结果显示:假伤组海马区域脑组织结构完整、清晰,极少量的淋巴细胞浸润,未见明显神经细胞坏死。脓毒症时,海马组织结构出现紊乱,组织中炎性细胞浸润明显增加,出现明显神经细胞水肿、坏死(图 3)。
2.3 脑组织细胞凋亡改变海马组织TUNEL染色结果显示:脓毒症时海马组织神经细胞与假伤组相比凋亡明显增强[平均荧光值(35±9.17)% vs.(1.67±1.53)%,P<0.01]。同样,脓毒症组海马组织caspase-3表达较假伤组明显增加[积分光密度(16.79±8.17) vs.(3.39±2.09),P<0.05](见表 1)。
(x±s) | |||
组别 | 鼠数 | TUNEL染色平均荧光值 | Caspase-3表达平均光密度 |
假伤组 | 10 | 2.33±0.57 | 3.39±2.09 |
脓毒症组 | 10 | 35.00±9.17b | 16.79±8.17a |
侧脑室注射假伤组 | 10 | 3.67±1.53d | 3.58±1.71c |
脓毒症+BoxA组 | 10 | 12.00±4.36d | 4.10±2.11c |
F值 | 25.95 | 6.579 | |
P值 | <0.01 | <0.05 | |
注:与假伤组比较,aP<0.05,bP<0.01;与脓毒症组比较,cP<0.05,dP<0.01 |
免疫荧光检测结果显示(图 1):脓毒症加侧脑室注射BoxA组海马组织HMGB1表达较脓毒症组明显降低[(2.66±2.06 )vs. (22.74±9.29),P<0.05],但侧脑室注射假伤组与脓毒症假伤组、脓毒症加侧脑室注射BoxA组与脓毒症假伤组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。Western blot分析显示(见图 4):脓毒症加侧脑室注射BoxA组海马组织HMGB1表达水平较脓毒症组明显下降[(0.42±0.13) vs.( 0.81±0.11),P<0.05],而侧脑室注射假伤组与脓毒症假伤组、脓毒症加侧脑室注射BoxA组与脓毒症假伤组比较均差异无统计学意义(P>0.05,表 2)。
(x±s) | |||
组别 | 鼠数 | HMGB1表达平均荧光密度 | HMGB1蛋白表达相对灰度值 |
假伤组 | 10 | 4.57±2.18 | 0.38±0.12 |
脓毒症组 | 10 | 22.74±9.29b | 0.81±0.11a |
侧脑室注射假伤组 | 10 | 4.91±2.29c | 0.39±0.20c |
脓毒症+BoxA组 | 10 | 2.66±2.06d | 0.42±0.13c |
F值 | 10.53 | 6.021 | |
P值 | <0.01 | <0.05 | |
注:与假伤组比较,aP<0.05,bP<0.01;与脓毒症组比较,cP<0.05,dP<0.01 |
海马HE染色显示(图 3),侧脑室注射假伤组海马组织结构清晰,形态基本正常。脓毒症加侧脑室注射BoxA组各个脑区形态学表现较脓毒症组组织损伤明显减轻,组织结构趋于正常,组织淋巴细胞浸润显著减少,并且坏死神经细胞数目明显下降。
2.6 侧脑室注射BoxA对脓毒症脑组织细胞凋亡的影响TUNEL染色显示:脓毒症加侧脑室注射BoxA组与脓毒症组比较,海马组织凋亡明显减少[(12.00±4.36) vs.(35.00±9.17),P<0.05],但脓毒症假伤组与侧脑室注射假伤组、脓毒症加侧脑室注射BoxA组与脓毒症假伤组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。进一步分析发现:脓毒症加侧脑室注射BoxA组海马组织caspase-3表达较脓毒症组明显下降[(4.10±2.11)vs.(16.80±8.17),P<0.05]。而海马组织caspase-3表达在脓毒症假伤组与侧脑室注射假伤组、脓毒症加侧脑室注射BoxA组与脓毒症假伤组比较均差异无统计学意义(P>0.05),表 1。
3 讨论脓毒症主要表现难以控制的系统性炎症反应,进而导致多器官功能障碍甚至衰竭,是脓毒症高病死率的一个重要原因。脑组织损伤在脓毒症早期即开始出现,危重者表现为不同程度意识障碍甚至昏迷,脓毒症患者好转后亦常常出现学习与记忆障碍,严重影响日常生活、工作[2, 6]。脓毒症所致脑损伤主要包括两个方面:神经炎症与缺血性损伤[7, 8]。在脓毒症早期,中枢TNF-α,IL-1β等促炎细胞因子表达上调,内皮细胞及小胶质细胞明显活化,神经毒性物质释放及氧化应激增加,进而诱导大量神经细胞凋亡、坏死,是造成脓毒症早期神经功能障碍的重要原因[8]。随着神经内分泌免疫研究的深入,认识到脑功能紊乱可能与外周免疫功能低下有关[9]。然而,目前对于脓毒症脑损伤的主要影响因素及作用机制尚未充分阐明,新近的资料提示HMGB1在脓毒症脑损伤中可能发挥重要作用[4]。但是,在脓毒症过程中,有关中枢HMGB1表达及与脑损伤的关系了解甚少。
业已明确,海马是机体控制学习与记忆的主要脑功能区。据报道,海马是脓毒症过程中大脑最易受损伤的区域之一,经静脉给予一定剂量脂多糖(LPS)时,海马组织出现明显的炎症反应及结构紊乱[10, 11]。本实验通过脑组织免疫荧光及Western blot技术证实,脓毒症组海马组织HMGB1表达较假伤组均明显增加,提示脓毒症状态下海马组织发生明显的神经炎症反应。有研究观察到,TNF-α、IL-6等促炎细胞因子水平在脓毒症早期明显升高,但在病程4~12 h呈现下降趋势[12],说明HMGB1可能是持续性脓毒症脑损伤的重要因素之一。进一步分析发现,脓毒症组海马出现不同程度的组织损伤,表现为大量炎性细胞浸润及神经细胞坏死,脑组织结构出现明显紊乱,提示HMGB1能通过促进局部炎症反应介导脑组织损伤。TUNEL染色显示,脓毒症时海马组织细胞凋亡明显增加,且caspase-3表达明显上调,表明HMGB1可能通过促进脑组织细胞凋亡参与脓毒症脑损伤过程。为了深入验证中枢HMGB1表达与脑损伤的关系,本实验采用小鼠侧脑室置管模型与脓毒症模型相结合,通过中枢直接拮抗HMGB1观察对脑组织损伤及细胞凋亡的影响。本组资料证实,中枢给予BoxA 后海马组织HMGB1表达较脓毒症组显著降低,并有效地减轻脑组织损伤,表现为炎症细胞浸润减弱及神经细胞坏死减少,组织结构紊乱缓解;同时,细胞凋亡及组织caspase-3表达呈现明显下降趋势,表明HMGB1作为一种中枢促炎因子,它在加重局部炎症反应的同时,可诱导神经细胞凋亡,促进组织损害;而抑制中枢HMGB1表达能明显减轻炎症反应,减少神经细胞凋亡,有效防止脑损伤的发生与发展。
HMGB1作为晚期重要的促炎细胞因子能通过活化细胞分泌及坏死细胞释放等方式到达胞外,参与炎症反应。已证明,胞外HMGB1能与细胞表面Toll样受体4或者糖基化终末产物受体结合发挥促炎效应,介导炎症反应;同时,过量HMGB1产生能导致抗原提呈细胞免疫功能障碍,并诱导Th细胞向Th2分化,导致机体免疫功能低下[13, 14],表明中枢HMGB1可能是脓毒症状态下炎症反应失控及免疫功能紊乱的重要因素之一。此外,在大鼠脑缺血模型中,HMGB1能作为一种早期始动炎症因子介导脑内急性期炎症反应,采用丙酮酸乙酯抑制HMGB1后小胶质细胞活化、神经细胞凋亡显著减轻,并能缓解脑水肿及脑损伤,说明HMGB1在中枢具有较强的致炎效应[15]。目前,研究认为针对HMGB1的治疗能充分延长脓毒症的治疗时间窗[12],本研究结果提示HMGB1与脓毒症脑损伤密切相关,进一步探讨HMGB1与脓毒症时多器官障碍的关系及其具体作用机制,将为寻求更有效的脓毒症干预策略开辟新途径。
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