中华急诊医学杂志  2016, Vol. 25 Issue (4): 418-422
对可溶性TOLL样受体2判断脓毒症患者血流感染病原菌临床价值的研究
路玲, 王勇强, 李寅, 窦琳, 高红梅     
300192 天津,天津市第一中心医院ICU
摘要目的 为脓毒症菌血症患者寻求可指导病原菌的标记物,以指导早期抗生素的合理使用。 方法 前瞻性观察天津市第一中心医院ICU 2012年8月至2015年3月的脓毒症患者147例,记录入住ICU确诊为脓毒症且血培养阳性时的常规检查:年龄、性别、生命体征、血常规、尿常规、便常规、出凝血项、血生化、C反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)、(1,3)-β-葡聚糖等,留取中心外周血培养,ELISA法测定可溶性TOLL样受体2(sTLR2)及白细胞介素-8(IL-8)表达量,计算急性生理学及慢性健康状况评分Ⅱ(APACHEⅡ 评分)等。计量资料假设检验采用单因素方差分析,计数资料采用χ2检验,绘制ROC曲线(受试者工作特征曲线)判断特异度和敏感度,以P<0.05为差异具有统计学意义。 结果 依据血培养结果分为3组:GP组[革兰阳性(G+)球菌组]、GN组[革兰阴性(G-)杆菌]组、FG组(真菌组),3组患者年龄、APACHEⅡ评分、生命体征指标和炎性指标体温、白细胞等基线水平相比,在血培养阳性时差异无统计学意义(P>0.05),所得结果亦显示本科致病菌以阴性菌为最常见。sTLR2的表达量在GP组与GN组中相比,在GP组中的表达量明显高于GN组,且差异具有统计学意义,P=0.000;sTLR2的表达量在在GP组与FG组中相比,差异无统计学意义,P=0.187,但(1, 3)-β-葡聚糖的表达量在FG组明显高于GP组,且差异具有统计学意义,P=0.000;sTLR2的表达量在GN组与FG组中相比,FG组中的表达明显高于GN组,且差异具有统计学意义,P=0.000。PCT、CRP及 IL-8在三组患者中两两比较差异无统计学意义(P>0.05)。诊断阴性菌感染时,sTLR2的曲线下面积为0.768,敏感度及特异度依次为88.90%及59.60%,最佳截断点为8.083 pg/mL,即sTLR2表达量高于8.083 pg/mL时,阴性菌感染的可能性较小,G+球菌、真菌等可激活细胞膜表面TLR2受体的病原菌可能性较大。PCT、CRP、(1,3)-β-葡聚糖及IL-8在诊断G-杆菌感染时差异无统计学意义,曲线下面积小于0.5。 结论 sTLR2结合(1, 3)-β-葡聚糖等炎性指标,可提示脓毒症患者病原菌类型。
关键词脓毒症     血流感染     炎性标记物     可溶性TOLL样受体2     (1,3)-β-葡聚糖     降钙素原     C-反应蛋白    
The study of clinical value of sTLR2 in identifying the pathogen of bloodstream infections in septic patients
Lu Ling, Wang Yongqiang, Li Yin, Dou Lin, Gao Hongmei     
Institute of Critical Care Medicine, the First Central Hospital, Tianjin, 300192, China
Corresponding author: GAO Hongmei, Email: 1249851980@qq.com
Fund program: Health Bureau Research Project of Tianjin(2010KG103);National Clinical Specialty Construction Project
Abstract: Objective To search specific biomarkers of pathogenic bacteria in patients with sepsis so as to guide early using rationally antibiotic treatment. Methods Prospective survey of 147 patients with sepsis in ICU was carried out from Jan 2012 to Mar 2015. When patients blood culture was positive, clinical data including age, gender, vital signs, blood and, urine routine examination, DIC, blood biochemistry, c-reactive protein (CRP), procalcitonin (PCT), microbial detection, etc were recorded. Cultured blood samples were from central venous catheter and peripheral vessel. ELISA method was employed to detect soluble toll-like receptor 2 (sTLR2) and interleukin-8(IL-8), and the Acute Physiology and Chronic Health Evaluation Ⅱ (APACHEⅡ score) was calculated. The chi-square test and analysis of variance were performed where necessary. Receiver operating characteristic (ROC) curves were used to calculate cut-points (CP) and area under the curve (AUC). Results According to the results of blood culture, patients were divided into three groups: GP group [gram-positive bacteria (G+) group]; GN group [gram-negative bacteria (G-) group]; FG group (fungi group). There were no significantly statistical differences in age, APACHEⅡ score, vital signs and markers of inflammation among three groups (P> 0.05). Gram negative pathogenic bacterium was the most common microbe. Compared with GN group, the level of sTLR2 in the GP group was obviously higher ( P= 0.000);but there was no significant difference in sTLR2 level between GP group and FG group (P= 0.187). The amount of (1, 3)-beta glucan in the FG group was significantly higher than that in the GP group (P= 0.000). The sTLR2 level in FG group was obviously higher than that in the GN group (P= 0.000). There were no significantly statistical differences in PCT, CRP and IL-8 among the three groups (P> 0.05). For the diagnosis of gram negative bacteria infection, sTLR2 area under the curve was 0.768, and the sensitivity and specificity were 88.90% and 59.60%, respectively and the best cut-off point was 8.083 pg/mL. Namely, the diagnosis of gram negative bacteria infection was less likely, when level of sTLR2 was higher than 8.083 pg/mL. The markers of PCT, CRP, (1, 3)- beta glucan and IL-8 were less valuable for the diagnosis of Gram negative bacteria infection because the area under the curve was less than 0.5. Conclusions The combination of inflammatory indicators such as sTLR2 and (1, 3) - beta glucan etc, can imply the kind of pathogenic microorganisms partly.
Key words: Sepsis     Bloodstream infections     Inflammatory markers     Soluble TOLL like receptor 2     (1, 3)-beta glucan     Calcitonin     C-reactive protein    

抗感染是脓毒症患者集束化治疗的重要组成部分,2012国际严重脓毒症及脓毒性休克诊疗指南推荐初始经验性抗感染治疗应包括可以覆盖所有可能的致病微生物(细菌和/或真菌或病毒)的一种或多种药物,并保证充分的组织渗透浓度,推荐每日评估抗微生物制剂是否有降级的可能,以防止出现细菌耐药、减少药物毒性并降低费用。广谱抗生素的使用,不仅仅可导致耐药菌的产生,同时,可对患者免疫系统带来损害,加大抗感染治疗的难度[1],故脓毒症患者针对性抗感染治疗亟待出现可指导病原菌的生物学标记物供临床使用,目前常见的PCT、CRP等指标广泛应用于临床,因其敏感度特异度均相对较低受到了一定的限制[2, 3]。近年来,国内外学者对sTLR2做了大量的研究工作,本研究拟探讨sTLR2与脓毒症患者血流感染病原菌类型的相关性。

1 资料与方法 1.1 一般资料

前瞻性观察天津市第一中心医院ICU 2012年8月至2015年3月的脓毒症患者147例,脓毒症的入选标准[4, 5],根据2001年华盛顿会议推荐,感染证据+SIRS诊断标准+器官损伤评分。

1.1.1 感染指标

确诊或高度疑似的感染,具备下列临床特征:①发热(深部体温>38.3 ℃)或低体温(深部体温<36.0 ℃);②心率>90次/min或>不同年龄正常心率的2个标准差;③气促,呼吸频率>30次/min;④意识状态改变;⑤明显水肿或液体平衡>20 mL/kg超过24 h;⑥血糖>7.7 mmol/L或110 mg/dL(无糖尿病史)。

1.1.2 炎症参数

①白细胞增多症(白细胞计数>12×109 L-1)或白细胞减少症(白细胞计数<4×109 L-1),白细胞计数正常但不成熟>10%;②C反应蛋白(CRP)>正常+2个标准差;③降钙素原>正常+2个标准差。

1.1.3 血流动力学参数

①低血压状态(收缩压<90 mmHg,平均动脉压<70 mmHg,或成人收缩压下降值>40 mmHg,1 mmHg=0.133 KPa),或按年龄下降>2个标准差;② 混合静脉血氧饱和度>70%;③心排指数<3.5 L/(min·m2 )。

1.1.4 器官功能障碍参数

①低氧血症(氧合指数PaO2/FiO2<300);②急性少尿[尿量<0.5 mL/(kg·h)持续2 h以上];③血肌酐增加≥44.3 mmol/L;④凝血异常(APTT>60 s或INR>1.5);⑤腹胀(无肠鸣音);⑥血小板减少症(血小板计数<100×109 L-1);⑦高胆红素血症(总胆红素>4 mg/L,或70 μmol/L);⑧高乳酸血症(>3 mmol/L);⑨毛细血管再充盈时间延长或皮肤出现花斑。

记录入住ICU确诊为脓毒症患者血培养阳性时的常规检查:年龄、性别、生命体征、血常规、尿常规、便常规、出凝血项、血生化、CRP、PCT、(1,3)-β-葡聚糖等;根据2014年欧洲危重病学会[7]提出的标准,计算确诊为菌血症时APACHEⅡ 评分。

1.2 微生物学方法

所有血标本取材按照医学检验学的相关标准,任何可疑污染的标本未送检。血培养标本分别取中心静脉和外周静脉血两不同部位的标本进行需氧菌与厌氧菌培养,中心静脉血与外周静脉血所得培养菌相同种类、相同药敏结果的致病菌认为是感染菌;分离菌株鉴定采用法国生物-梅里埃公司VITEK微生物鉴定系统,同时药敏应用K-B纸片扩散法,按NCCLS(2002年版)标准进行。

1.3 ELISA法检测sTLR2、IL-8的含量

留取血培养标本时同时留取3~5 mL静脉血于干管中,立即给予1 000 r/min离心15 min,收集血清冻存于-80 ℃冰箱中待用。严格依据美国sigma公司(sTLR2) ELISA Kit、(IL-8) ELISA Kit说明书步骤酶标仪上读取450 nm 处的吸光度值。根据标准曲线计算出sTLR2、IL-8的含量。

1.4 统计学方法

所有计数资料及计量资料使用SPSS17.0软件统计分析,计量资料采用均数±标准差(x±s)表示,三组患者的基线水平指标、炎性标记物等假设检验采用单因素方差分析。测量炎症指标PCT、CRP、(1,3)-β-葡聚糖、IL-8和sTLR2,评估其判断病原菌的特异度和敏感度,绘出ROC曲线(受试者工作特征曲线)。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 发病情况

147例脓毒症患者原发病情况见表 1

表 1 脓毒症原发病构成情况Table 1 Composition of patients with sepsis primary diseases
病原菌构成比(%)
肺炎31.32
多发伤16.80
外伤术后12.65
病理产科10.22
慢性阻塞性支气管炎8.83
白血病7.79
严重烧伤4.43
腹膜炎4.03
胆管炎2.01
泌尿系统感染1.19
其他0.73
2.2 病原菌分布

2012.08~2015.08的本科脓毒症患者感染菌前10位病原菌分布见表 2。本科脓毒症患者病原菌以阴性菌为最常见,前三位依次为:大肠埃希、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌。

表 2 本科脓毒症患者感染菌前10位病原菌分布情况Table 2 Distribution of the top 10 infected pathogens in patients with sepsis
病原菌构成比(%)
大肠埃希15.62
肺炎克雷伯菌12.40
铜绿假单胞菌11.92
鲍曼不动杆菌6.71
屎肠球菌4.54
金黄色葡萄球菌3.83
表皮葡萄球菌3.40
粪肠球菌3.11
奇异变形杆菌2.40
噬麦芽窄食单胞菌1.35
2.3 三组患者基线水平的比较

所得结果显示,在血培养阳性时,年龄、APACHEⅡ评分、生命体征、基础病情况等基线指标,分别在三组患者之间进行比较时,差异无统计学意义(P>0.05),见表 3

表 3 三组患者基线水平的比较Table 3 Comparison of baseline in the three groups of patients

指标

GP组GN组FG组FPP1P2P3
年龄(岁)53.592±19.84956.068±19.20554.409±18.6740.2150.8070.6260.8830.542
APACHEⅡ(分)16.111±6.94619.620±7.65514.818±6.3660.4190.6590.7880.5260.370
T(℃)37.540±1.07737.851±1.07837.190±1.0740.0480.9530.7580.8720.898
P(次/min)109.296±27.941115.517±28.897119.00±21.5930.8450.4340.3860.2100.646
R(次/min)28.148±21.92926.896±14.22625.181±6.1070.2110.8100.7690.5180.704
MAP(mmHg)79.074±13.81779.758±12.87281.863±11.6010.3020.7400.8430.4530.565
WBC (×109/L-1)17.491±11.86614.979±5.18917.325±6.8780.7530.4740.2720.9460.946
N(%)80.365±16.88482.468±7.58883.927±10.1501.3650.1010.1330.3130.308
Hb(g/L)99.250±2.09291.030±1.26392.720±1.4531.9570.1480.0610.1680.708
Cr(μmol/L)152.777±21.882134.275±19.798136.818±22.1740.2610.7710.4910.6080.899
Lac(mmol/L)5.159±2.4235.127±2.5705.345±2.5261.4010.2530.9600.1410.145
注:GP组革兰阳性菌组;GN组革兰阴性菌组;FG组真菌组;P1 GP组与GN组相比;P2GP组与FG组相比; P3GN组与FG组相比
2.4 血培养阳性时炎性标记物表达量

sTLR2的表达量:GP组与GN组中相比,在GP组中的表达量明显高于GN组,差异具有统计学意义,P1=0.000;GP组与FG组中相比,差异无统计学意义,P2=0.187。但(1,3)-β-葡聚糖的表达量在FG组明显高于GP组,且差异具有统计学意义,P2=0.000;sTLR2的表达量:GN组与FG组中相比,FG组中的表达明显高于GN组,差异具有统计学意义,P3=0.000。PCT、CRP及 IL-8在三组患者中相比较差异无统计学意义。见表 4。诊断阴性菌感染时,sTLR2的曲线下面积为0.768,敏感度及特异度依次为88.9%及59.6%,最佳截断点为8.083 pg/mL,即sTLR2表达量高于8.083 pg/mL时,阴性菌感染的可能性较小,阳性菌、真菌等可激活细胞膜表面TLR2受体的病原菌可能性较大。PCT、CRP、(1,3)-β-葡聚糖及IL-8在诊断阴性菌感染时差异无统计学意义,曲线下面积小于0.5,见表 5

表 4 炎性标记物表达量在三组患者中的比较Table 4 Comparison of quantity of inflammatory markers in three groups of patients
指标GP组GN组FG组FPP1P2P3
PCT(ng/mL)12.885±5.81210.605±5.3289.614±3.7172.7080.0730.0970.0290.492
CRP(mg/L)68.804±13.08281.056±26.33478.135±23.0430.6450.5280.2740.4410.805
(1, 3)-β-葡聚糖(pg/mL)103.481±19.94299.033±17.562575.181±195.867164.3240.0000.8730.0000.000
IL-8(pg/mL)198.127±34.140195.731±27.432200.116±25.3170.1440.8660.7590.8140.596
sTLR2(pg/mL)9.880±1.9766.372±.5399.717±3.48330.1240.0000.0000.1870.000
注:注:GP组:革兰阳性菌组 GN组:革兰阴性菌组 FG组:真菌组 ;P1 :GP组与GN组相比;P2: GP组与FG组相比; P3:GN组与FG组相比
表 5 炎性标记物的ROC曲线分析结果Table 5 Results of ROC curve analysis inflammatory markers

指标

曲线下面积最佳截断点敏感度(%)特异度(%)Youden指数
PCT0.6246.9400.8150.3270.142
CRP0.38761.0700.3330.4620.205
(1,3)-β-葡聚糖0.32885.5000.7770.1540.068
IL-80.490176.3570.6670.2500.083
sTLR20.7688.0830.8890.5960.485
3 讨论

2012年国际严重脓毒症及脓毒性休克诊疗指南指出,抗感染治疗原则为积极清除感染灶和去除感染的病因和诱因,经验性治疗应根据患者现有疾病和当地病原菌分布特点,尽可能针对最有可能的病原菌使用抗菌药物,对严重脓毒症患者,建议经验性联合治疗不超过3~5 d,一旦病原菌的药敏确定,应立即降级到最恰当的单药治疗[8],故早期可提示感染菌类型的炎症指标,对正确指导使用抗生素具有重要的临床意义。

目前临床常用的炎症相关指标如:PCT、CRP、(1,3)-β-葡聚糖、IL-8等,相关指南指出[7]:低水平PCT可辅助对疑似脓毒症而无相应感染证据的患者停止抗菌药物经验性使用,CRP可辅助鉴别诊断脓毒症与SIRS,(1,3)-β-葡聚糖可提示真菌感染,但其敏感度及特异度相对较差,故PCT、CRP等炎性指标在判断病原菌方面的价值非常有限。本研究结果显示,PCT、CRP在G-杆菌感染菌血症患者、G+球菌感染菌血症患者、真菌感染菌血症患者中的表达差异无统计学意义。

但临床亟待出现可指导不同菌感染的标记物指导临床医师针对性使用抗生素。本研究发现,在年龄、APACHEⅡ评分、基础病情况等基线水平差异无统计学意义的G-杆菌菌血症患者、G+球菌菌血症患者、真菌菌血症患者血液中,sTLR2在G-杆菌菌血症患者的表达明显低于G+球菌菌血症患者及真菌菌血症患者,且其ROC工作曲线显示,其曲线下面积为0.768,特异度及敏感度依次为59.60%及88.90%,本研究结果仍显示,(1,3)-β-葡聚糖的表达量在FG组明显高于GP组及GN组,sTLR2结合(1,3)-β-葡聚糖等可提示病原菌类型,(1,3)-β-葡聚糖可提示真菌感染的相关研究国内外文献报道较多,本研究认为sTLR2可作为鉴别病原菌的指标之一,理由如下:①随着近年来对感染机制的进一步研究认为,炎症反应为免疫系统参与的,致炎成份激活炎性细胞及内皮细胞表面膜受体TOLL样受体(TLRs),TLRs通过PAMPs / DAMPs途径激活细胞核内NF-κB,AP-1和IRF3等因子,促进促炎因子IL-8等及抗炎因子IL-10等的释放[8]。研究表明G-杆菌致病因子脂磷壁酸(LPS)激活炎性细胞及内皮细胞细胞膜表面TOLL样受体4(TLR4),G+球菌的致病因子脂磷壁酸(LTA)及真菌致病因子激活细胞膜表面TOLL样受体2(TLR2)[9]。②近年来,对sTLR2的理论研究国内外学者进行了大量的研究工作,研究证实其为炎症反应过程中在酶ADAM10或ADAM17参与下,激活的TLR2在翻译水平释放的片段[10],sTLR2为机体负性调节TLR2过度表达的保护性调节因子[11],sTLR2产生的特殊机制说明sTLR2的产生量与TLR2的表达具有相关性,其表达量的变化可反映炎症反应的程度。③大量的研究表明,sTLR2在炎症反应过程中伴随着TLR2的表达而表达,如在牙髓炎患者的唾液中[12],羊膜腔感染患者的羊水中[13],急性心肌梗死伴有心功能不全患者的血液中[14],在不同部位启动TLR2的化学反应相应体液中可检测到,标本来源具有广泛性。④有研究表明,sTLR2为水溶性,具有一定的化学稳定性[15],其化学特性决定了在临床具有可监测性。⑤重症监护脓毒症患者病原菌以G-杆菌为最常见[16]。本研究结果所示,sTLR2在G-杆菌感染的脓毒症患者中表现较其他均较低,在监护室有一定的广泛性。综上所述,sTLR2可作为病原菌标记物进一步研究,以指导早期合理使用抗生素。

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