2016, Vol. 25
鲍曼不动杆菌具有较强的获得耐药与克隆传播能力，耐药菌已呈世界流行趋势，其耐药性的发展与传播已引起临床广泛关注[1, 2]。根据2014年中国CHINET细菌耐药性监测网数据显示，我国主要地区17所教学医院不动杆菌属占临床分离菌的11.11%，仅次于大肠埃希菌与克雷伯菌属，居不发酵糖革兰阴性杆菌的首位[3]。不动杆菌属中93%为鲍曼不动杆菌，19.7%属于广泛耐药(XDR)菌。XDR鲍曼不动杆菌主要分布在重症监护病房(ICU)，并存在耐药克隆传播风险。
鲍曼不动杆菌属于条件致病菌，广泛存在于医院环境，易在患者皮肤、呼吸道等部位定植。其感染常见于危重患者，病死率较高。其感染危险因素包括：入住重症监护室、住院时间长、机械通气、长时抗菌药物暴露、侵入性操作及存在严重基础疾病等[4]。肺脏是该菌感染的最常见靶器官，是引起医院获得性肺炎(HAP)，特别是呼吸机相关性肺炎(VAP)重要致病菌[5]。
浙江大学医学院附属邵逸夫医院某ICU楼层有24张病床，分布在9个相对独立区域，其中7个为2人房间，1个为4人房间，另1个为6人房间；因空间受限，未配置单间。近期病区发生一起鲍曼不动杆菌的流行，前后共有8例患者呼吸道标本同时培养出该菌，医院感染科及时介入，进行病房环境监测，病菌同源分析，查明传染源；同时加强环境消毒和手卫生，避免了其进一步扩散。现将同源检测结果及院感控制等资料回顾总结如下。
1 资料与方法 1.1 呼吸机相关性肺炎(VAP)的诊断VAP的诊断参照2013年中华医学会重症医学分会制定的指南执行[6]，包括临床诊断和微生物学诊断，同时结合临床肺部感染评分(CPIS)[7]。
1.2 一般资料记录该8例鲍曼不动杆菌肺炎患者的性别、年龄、是否抽烟、ICU居住空间、APACHE Ⅱ评分、CPIS分值、主要诊断、行同源性分析前已住ICU时间及同源性分析前已培养到该菌的持续时间。选取最近一次下呼吸道标本内分离到的鲍曼不动杆菌菌株作同期检测分析。回顾汇总该8例鲍曼不动杆菌肺炎患者的住ICU时间、呼吸机支持时间、气道分泌物该菌培养阳性持续时间、临床所选抗生素、抗菌药物使用疗程、细菌药敏结果、脉冲场凝胶电泳(PFGE)细菌克隆分型及患者最后临床转归。环境采样点包括床按钮、床栏、床帘、呼吸机、监护仪、电脑、护士桌面、操作台、微泵、地板、水槽、床边护士与护工的手等，某些区域同时取两份标本。
1.3 主要设备VITEK2 DensiCHEK Plus 比浊仪(法国生物梅里埃公司)；CHEF-Mapper XA 型脉冲电泳仪(美国Bio-Rad公司)；限制性内切酶ApaI(日本TaKaRa公司)。
1.4 检测方法病区环境采样与克隆鉴定步骤：(1)棉签采样100 cm2，编号注明地点；(2)浸泡于4 mL胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)(含0.25 mg/L 头孢噻肟、8 mg/L万古霉素)内，37 ℃摇菌过夜；(3)取100 μL菌液，分区接种至血平板，挑选克隆做分子鉴定。
PFGE按照文献[8, 9, 10]报道的方法进行。主要步骤：制备琼脂糖胶块、消化、限制性内切酶酶切、脉冲电泳、染色成像及结果解读。具体包括：将培养过夜的细菌用低熔点胶灌膜；蛋白酶K消化过夜；用限制性内切酶ApaI酶切12 h；脉冲场凝胶电泳：1%胶，0.5TBE缓冲液，14 ℃，6 V/cm，脉冲角度120°，脉冲时间5~20 s，电泳22 h。
结果根据目测条带分析，图谱完全相同者为同一型，相差一个条带为同一型的不同亚型，相差2~3个条带为密切相关，相差4~6个条带为可能相关，相差7个条带以上的则认为无亲缘关系。随机选择不同字母如A、B、C、D等按序分型。
2 结果鲍曼不动杆菌肺炎患者的一般情况，包括年龄、主要诊断、空间分布等，见表 1。该8例患者的回顾性资料及细菌同源检测结果，包括住ICU时间、抗生素种类、患者转归、PFGE细菌克隆分型结果等，见表 2。该8株鲍曼不动杆菌菌株的药敏结果和最低抑菌浓度(MIC)值见表 3。病房环境采样所培养到的细菌汇总见表 4，其中鲍曼不动杆菌环境检测阳性率为62% (31/50)。患者与环境采样培养到的鲍曼不动杆菌的PFGE克隆分型图谱见图 1-3，图 4为该菌克隆分型中，主要的四种基因型图谱。分型结果汇总见表 5。
| 患者 | 空间 | 性别 | 年龄(岁) | 抽烟 | APACHE Ⅱ | T1(d) | T2(d) | CPIS | 主要诊断 |
| P1 | 1-1 | M | 72 | N | 25 | 21 | 13 | 5 | 心脏瓣膜病，肺炎 |
| P2 | 1-2 | M | 67 | N | 34 | 8 | 5 | 8 | 肺癌，肺炎 |
| P3 | 2-2 | M | 81 | N | 21 | 17 | 5 | 6 | 颅脑外伤，肺癌，肺炎 |
| P4 | 3-2 | M | 88 | N | 20 | 25 | 22 | 7 | 脑梗死，COPD，肺炎 |
| P5 | 5-2 | M | 49 | N | 30 | 16 | 11 | 6 | 重症胰腺炎，MOF，肺炎 |
| P6 | 6-1 | F | 35 | N | 29 | 8 | 3 | 5 | 脑炎，肺炎 |
| P7 | 6-4 | M | 69 | Y | 15 | 26 | 10 | 6 | Ⅰ型主动脉夹层，肺炎 |
| P8 | 8-1 | F | 78 | N | 28 | 15 | 8 | 5 | 肠梗阻，肠坏死，肺炎 |
| 注：P1-8 第1-8例患者；空间 ICU内床号，如1-1表示1号房间1床；M 男性，F 女性；N 否，Y 是；APACHE Ⅱ 入ICU 24 h的评分值；T1 行同源性分析前患者已住ICU时间；T2 行同源分析前患者气道分泌物标本已培养到鲍曼不动杆菌的时间；CPIS 临床肺部感染评分；COPD 慢性阻塞性肺病；MOF 多器官功能衰竭 | |||||||||
| 患者 | T1(d) | T2(d) | T3(d) | 药敏 | 临床选用抗生素 | T4(d) | 克隆 | 转归 |
| P1 | 34 | 32 | 27 | MDR | 替加环素+头孢哌酮舒巴坦 | 21 | A | 好转 |
| P2 | 14 | 14 | 10 | S | 美洛培南 | 10 | O | 死亡 |
| P3 | 38 | 38 | 15 | MDR | 头孢哌酮舒巴坦+依替米星 | 15 | A | 死亡 |
| P4 | 48 | 45 | 24 | S | 头孢哌酮舒巴坦 | 22 | G | 好转 |
| P5 | 114 | 46 | 86 | MDR | 头孢哌酮舒巴坦+环丙沙星 | 24 | A | 好转 |
| P6 | 12 | 12 | 3 | MDR | 替加环素+头孢哌酮舒巴坦 | 3 | B | 死亡 |
| P7 | 67 | 58 | 57 | MDR | 替加环素 | 18 | E | 好转 |
| P8 | 29 | 20 | 50 | MDR | 头孢哌酮舒巴坦 | 16 | E | 好转 |
| 注：P1-8 第1-8例患者；T1 住ICU时间；T2 呼吸机支持通气时间；T3 患者气道分泌物标本培养到鲍曼不动杆菌的持续时间；T4 临床抗鲍曼不动杆菌药物治疗时程；S 敏感，指体外药敏结果中对少于3类潜在有活性的抗菌药物耐药；MDR 多重耐药，指体外药敏结果中对3类及以上潜在有活性的抗菌药物耐药；克隆 细菌体外脉冲场凝胶电泳(PFGE)中基因分型 | ||||||||
| 患者 | 舒普深(纸片法) | 哌拉西林他唑巴坦 | 亚胺培南 | 氨曲南 | 丁胺卡那霉素 | 左氧氟沙星 | 替加环素(纸片法) |
| P1 | R 15 | R ≥128 | R ≥16 | R 32 | S 4 | I 4 | S 16 |
| P2 | S 30 | S ≤4 | S ≤1 | R 32 | S ≤2 | S ≤0.25 | S 21 |
| P3 | R 15 | R ≥128 | R ≥16 | R 32 | S 4 | I 4 | S 16 |
| P4 | S 28 | S ≤4 | S ≤1 | I 16 | S ≤2 | S ≤0.25 | S 21 |
| P5 | R 15 | R ≥128 | R ≥16 | I 16 | S ≤2 | I 4 | S 16 |
| P6 | R 12 | R ≥128 | R ≥16 | R ≥64 | R ≥64 | S 2 | S 20 |
| P7 | R 13 | R ≥128 | R ≥16 | R ≥64 | R ≥64 | R ≥8 | S 17 |
| P8 | R 14 | R ≥128 | R ≥16 | R ≥64 | S 4 | R ≥8 | S 17 |
| 注：P1-8 第1-8例患者；MIC 最低抑菌浓度；R 耐药；I 中敏；S 敏感；舒普深 头孢哌酮舒巴坦；本单位未开展对四环素、多黏菌素的常规药敏试验 | |||||||
| 采样点 | 细菌 | 采样点 | 细菌 | 采样点 | 细菌 | 采样点 | 细菌 | 采样点 | 细菌 |
| 1-1-a | Ab | 3-1-b | Ab | 5-2-b1 | Ab | 6-1-a | Ab | 6-g | Ab |
| 1-1-b | Ab | 4-1-a | Ab | 5-2-b2 | Pa | 6-1-b | Ab | 8-1-a | Ab |
| 1-1-c | Ab | 4-1-b | Ab | 5-2-c | Kp | 6-1-c | Ab | 8-1-b | Ab |
| 1-2-a | Ab | 4-1-d | Kp | 5-2-e1 | Pa | 6-1-f | Ab | 8-1-c | Ab |
| 1-2-b | Asp. | 5-1-a | Asp. | 5-2-e2 | Kp | 6-1-j | Pa | 8-1-e | Ab |
| 1-g | Ab | 5-1-b1 | An | 5-2-f | Kp | 6-4-a | Kp | 8-1-f | Ab |
| 2-2-b1 | Ab | 5-1-b2 | Pa | 5-g | Kp | 6-4-b1 | Kp | 8-1-j | Ab |
| 2-2-b2 | Ab | 5-1-e1 | Ab | 5-h | Ab | 6-4-b2 | Ab | 8-h | Ab |
| 2-g | Ab | 5-1-e2 | Pa | 5-i | Cf | 6-4-f | Kp | 8-i | Pa |
| 3-1-a | Ab | 5-2-a | Ab | 5-k | Ac | 6-6-d | Ab | L | Ab |
| 注：第一位数字代表房间号，第二位数字代表床号，小写字母后数字代表同一采样点取样序号，字母a-床按钮、床栏，b-呼吸机，c-监护仪，d-桌面，e-操作台，f-微泵，g-床边护士手，h-地板，i-水槽，j-床帘，k-电脑，L-护工手；如2-2-b2表示2号房间2床呼吸机表面第2份采样。Ab 鲍曼不动杆菌；Ac 醋酸钙不动杆菌；An nosocomialis不动杆菌(不动杆菌基因型13TU)；Asp. 不动杆菌属；Cf 弗氏枸橼酸杆菌；Kp 肺炎克雷伯菌；Pa 铜绿假单胞菌。鲍曼不动杆菌环境检测阳性率62%(31/50) | |||||||||
| 采样点 | 克隆 | 采样点 | 克隆 | 采样点 | 克隆 | 采样点 | 克隆 |
| P1 | A | 5-h | A | 6-g | C | 6-6-d | D |
| P3 | A | 6-1-b | A | 8-1-a | C | L | D |
| P5 | A | P6 | B | 8-1-b | C | P7 | E |
| 1-1-a | A | 3-1-b | B | 8-1-c | C | P8 | E |
| 1-1-b | A | 4-1-a | B2 | 8-1-e | C | 2-2-b1 | F |
| 1-1-c | A | 4-1-b | B | 8-1-f | C | P4 | G |
| 1-2-a | A | 1-g | C | 8-1-j | C | 6-1-a | H |
| 3-1-a | A | 2-g | C | 8-h | C | 2-2-b2 | N/A |
| 5-1-e1 | A | 5-2-a | C | 6-1-c | D | P2 | O |
| 5-2-b1 | A | 6-4-b2 | C | 6-1-f | D | ||
| 注：P1-8 第1-8例患者；第一位数字代表房间号，第二位数字代表床号，小写字母后数字代表同一采样点取样序号，字母a-床按钮、床栏，b-呼吸机，c-监护仪，d-桌面，e-操作台，f-微泵，g-床边护士手，h-地板，i-水槽，j-床帘，k-电脑，L-护工手；如2-2-b2表示2号房间2床呼吸机表面第2份采样。B2 B亚克隆；N/A 未知克隆；克隆 细菌体外脉冲场凝胶电泳(PFGE)中基因分型 | |||||||
 |
| M：标记带；P1-8：第1-8例患者；第一位数字代表房间号，第二位数字代表床号，小写字母后数字代表同一采样点取样序号，字母a-床按钮、床栏，b-呼吸机，c-监护仪，d-桌面，e-操作台，f-微泵，g-床边护士手，h-地板，i-水槽，j-床帘，k-电脑，L-护工手；如2-2-b2表示2号房间2床呼吸机表面第2份采样。B2：B亚克隆；克隆：细菌体外脉冲场凝胶电泳(PFGE)中基因分型 图 1 患者呼吸道与环境采样处培养到的鲍曼不动杆菌的克隆分型图谱 |
 |
| 图 2 患者呼吸道与环境采样处培养到的鲍曼不动杆菌的克隆分型图谱(图注同图1) |
 |
| 图 3 患者呼吸道与环境采样处培养到的鲍曼不动杆菌的克隆分型图谱(图注同图1) |
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| 图 4 患者呼吸道与环境采样处培养到的鲍曼不动杆菌的克隆分型图谱（图注同图1） |
该ICU病区的机械通气患者中，除了先前呼吸道标本中已培养到鲍曼不动杆菌的4例患者外，近1周内，又新出现了4例患者呼吸道标本培养该菌呈阳性。从药敏结果初步判断，培养到的鲍曼不动杆菌至少有两种不同菌株， 一株对多数抗生素敏感，另一株显示多重耐药。结合患者基础疾病与本次入院病史，临床考虑8例患者均为院内鲍曼不动杆菌肺炎，属于呼吸机相关性鲍曼不动杆菌肺炎，依据药敏结果和相关指南推荐，及时选用了恰当抗生素抗感染治疗[11, 12]。细菌分子分型采用了PFGE技术，相对于PCR方法，PFGE基因分型目前是鉴别细菌种属的金标准技术，但其也有缺点，如较昂贵、费时[8, 13, 14]。
CPIS综合了临床、影像学和微生物学的情况，内容包括体温、外周血白细胞计数、气管分泌物情况、氧合指数(PaO2/FiO2)及胸片等[7]。其对VAP的诊断进行了量化，但其诊断强度属于中等，故仅作为评估VAP严重程度的辅助工具。本研究中，有3例患者CPIS值为5分，低于界值6分，但临床仍诊断为VAP。
环境采样培养时，因杂菌较多，影响了目标菌的挑选与鉴别。故在培养中，加用了头孢噻肟与万古霉素，用以抑制药物敏感的革兰阳性菌和阴性菌，有利于鲍曼不动杆菌多重耐药克隆的生长，以达到筛选目标菌的目的；但此方法也会影响头孢噻肟敏感的细菌，包括鲍曼不动杆菌敏感株的检出。
环境采样培养的结果显示，耐药鲍曼不动杆菌检出率较高(62%)，其他细菌有肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、弗氏枸橼酸杆菌等。同时，采样中也培养到不动杆菌其他种属，如醋酸钙不动杆菌和nosocomialis不动杆菌(不动杆菌基因型13TU)。两者与pittii不动杆菌(不动杆菌基因型3)、鲍曼不动杆菌统称为鲍曼不动杆菌复合体，相互间生物表型十分接近，需要分子水平分型才能区分。醋酸钙不动杆菌大都在环境中才分离到，而后三种则是院内感染的重要致病菌。不同种属细菌感染的流行特征、临床表现、耐药性及治疗选择亦有不同。故病区存在鲍曼不动杆菌疑似流行时，需要实验室来鉴别该菌的不同种属，以利临床判断和院感控制。
该组人群院内死亡3例；死亡的3例患者中，除了患HAP外，还存在极重的基础疾病，如晚期肺癌、重度颅脑外伤、脑炎，尽管1例患者肺部感染菌为敏感菌株(O克隆)，但抗感染疗效及预后仍较差。8例患者感染的细菌从PFGE克隆分型看，属于5种不同基因型细菌，其中A克隆3例，E克隆2例，B、G、O克隆各1例。结果提示，虽然8例患者中同时培养到了鲍曼不动杆菌，却不属于同一克隆型；尤其是培养到O克隆菌株的患者，其临床培养和药敏报告的是鲍曼不动杆菌，实际上属于鲍曼不动杆菌复合体中的其他型。
患者与环境采样处培养到的鲍曼不动杆菌PFGE分型结果显示，环境中以C克隆(12/31)和A克隆(9/31)菌株为多，却未发现C克隆菌株感染的患者。有2例E克隆患者、1例G与O克隆患者，但在环境中却没有分离到相应克隆；由于环境采样只是选择地选取了一些位置，其余部位可能存在如E、G、O等克隆菌株，故尚不能明确这几例患者感染菌与环境定植菌的相关性。综合表明，借助于PFGE细菌基因分型，本次耐药菌流行可能属于“巧合”，而不是环境或患者感染的某一克隆株播散所致。尽管不属于严重的耐药菌爆发流行，但因2例以上患者存在同一克隆株感染，本院仍加强了院感控制，包括环境消毒与手卫生防护，防止病菌扩散。
鲍曼不动杆菌院内感染播散的途径主要为接触传播，医院感染的预防与控制极其重要，包括严格无菌操作规范、加强手卫生、实行接触隔离、加强环境消毒与清洁等。如出现MDR鲍曼不动杆菌的疑似暴发或流行，应及时对患者周围环境、设备、医护人员手与衣服等处进行微生物标本采样培养，进行耐药菌筛查，运用PFGE等方法，明确感染来源。
总之，病房内出现耐药鲍曼不动杆菌流行时，须及时查明传染源与传播途径，采取有效措施防止其扩散。PFGE主要用于细菌分子分型，对于院内感染的监测、溯源与控制具有重要意义。
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