笔者前期的研究中发现，缺血-再灌注肝损伤中过度表达的热休克蛋白72(heat shock protein 72,HSP72)可以释放至细胞外，并作为Toll样受体的内源性配体启动炎性应答而导致肝组织细胞损伤^{[1, 2]}；HSP72 siRNA能抑制体外热应激肝细胞释放HSP72^[3]。本研究利用超声微泡造影剂结合HSP72siRNA，并靶向转染入肝组织，观察HSP72siRNA在肝组织细胞内的表达及对肝组织细胞损伤的影响。

雄性SD 大鼠72只，6~8 周龄，清洁级，体质量220~260 g，由浙江大学医学院实验动物中心提供。声诺维购于Bracco International B.V.公司；HSP72 siRNA质粒由本课题组制备^[1]；RT-PCR及Western blot试剂盒购于美国Invitrogen公司。

取声诺维(注射用六氟化硫微泡)1支，使用前向装有冻干粉末的小瓶内注入注射用生理盐水5 mL，用力振摇至冻干粉末完全溶解。完全溶解后，六氟化硫微泡直径约2.5 μm。微泡浓度计算：经反复计数，声诺维微泡浓度约为300×10⁶个/mL，每孔的微泡量为30 μL，每孔液体总量为500 μL，每孔微泡浓度为：300×10⁶个／mL×(0.03 mL/0.5 mL)≈1.8×10⁷个/mL。超声诊断仪选用ESAOTE MyLab30，LA532E 探头，频率2.50 MHz,谐波成像模式，MI设置为1.01。

随机(随机数字法)分为非手术组(N组)、假手术组(P组)及肝缺血-再灌注组(I/R组)。N组大鼠仅常规饲养未予手术处理；P组大鼠常规饲养后给予开腹、关腹处理；I/R组大鼠麻醉、上腹正中切口，切开腹壁各层，分离肝十二指肠韧带，暴露肝门部，用无创动脉夹阻断门静脉进入肝脏第一次分叉的远端，造成约70%肝脏缺血，保留动脉夹，关闭腹腔，45 min后恢复灌注。I/R组大鼠分为4组(每组6只)，分别在实验前1 h静脉给予:①220 μL生理盐水(A组)；②20 μL HSP72 siRNA质粒载体+200 μL生理盐水(B组)；③20 μL HSP72 siRNA质粒载体+200 μL超声微泡造影剂(C组)；④20 μL HSP72 siRNA质粒载体+200 μL超声微泡造影剂+机械指数1.0超声波照射靶区域(D组)。D组在静脉注射微泡后用超声探头经皮辐照全肝15 min，方法为较均速来回摆动探头，同时观察超声仪屏幕，保证全部肝组织受到超声波辐照。各组大鼠于实验后24 h分别处死，收集血浆及肝组织备用。

全自动生化分析仪检测各组大鼠血浆ALT含量(肝功能受损指标)，ELISA检测各组大鼠血浆HSP72、TNF-α(肝组织炎性损伤指标)含量，操作按说明。

肝组织以4%甲醛固定，常规石蜡包埋，制作组织切片，进行HE染色，使用图像分析系统对肝组织胶原染色面积进行定量分析；资深病理科医师阅片，二者综合分析动物模型肝组织细胞损伤程度。

根据Genbank中大鼠HSP72 mRNA序列，用分子生物学软件Oligo5.0设计引物。上游引物为：5’-GCC ATG GCC AAG AAC ACG GCG ATC GGC ATC-3’；下游引物为：5’-CTA ATC CAC CTC CTC GAT GGT GGG TCC TGA GC-3’。引物由上海生工生物工程有限公司合成并经PAGE纯化定量。按Invitrogen公司操作说明提取总RNA，RT-PCR检测HSP72 mRNA的表达情况。大鼠肝组织匀浆、Trizol抽提RNA，禽类成髓纤维病毒逆转录酶(A-MV酶)42 ℃逆转录，RT-PCR扩增HSP72 cDNA，扩增参数：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，共36循环；72 ℃ 延伸5 min。检测中以β-actin作为参照。置凝胶电泳处理系统(YLN2000)成像，Tanon Gis2.0软件半定量分析HSP72/β-actin灰度比值。

肝组织蛋白裂解液加入20 μL PBS混匀，按1：1比例各自加入等体积2×SDS上样缓冲液混匀，沸水中煮10 min裂解、离心，行10% SDS-PAGE电泳后，在转移槽中将蛋白从凝胶转移至PVDF膜上，TBS缓冲液洗膜、封闭、4 ℃过夜。加入TBS缓冲液稀释的山羊抗大鼠HSP72的多克隆抗体(1：1 000)作为一抗，37 ℃孵育1.5 h，TBS洗膜后加入生物素化的IgG作为二抗，37 ℃孵育1.5 h、TBS缓冲液洗膜后，将膜浸入DAB显色液中，室温闭光显色20 min，蒸馏水终止反应。检测中以GADPH作为参照。Tanon Gis2.0软件半定量分析HSP72/GADPH灰度比值。

采用SPSS 10.0统计分析软件，所得数据用均数±标准差(x±s)表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异具有统计学意义。

N组、P组的各实验组大鼠的肝组织标本未见明显组织细胞损伤现象，肝细胞索排列正常，肝窦无紊乱、充血，肝细胞无变性及坏死，局部可见少量中性粒细胞浸润(图 1A)；I/R A组肝细胞索结构紊乱，大片肝细胞出现空泡样变性及点状、小片状肝细胞坏死，大部分肝窦可见淤积的红细胞和微血栓(图 1B)；I/R B、C组中肝细胞受损较I/R A组有所减轻，肝细胞索基本正常，肝细胞空泡样变性仍较明显，点状坏死相对减少，少数肝窦内可见红细胞淤积和微血栓形成(图 1C、D)；I/R D组肝细胞索排列正常，局部可见肝细胞空泡样变性及少量中性粒细胞浸润(图 1E)。

A：P组；B：I/R A组；C：I/R B组；D：I/R C组；E：I/R D组 图 1 各组大鼠于实验后24 h肝组织病理(HE×100)

图选项

N组、P组大鼠经不同处理后血浆ALT、HSP72和TNF-α含量差异均无统计学意义(N组：F_ALT=2.13,P>0.05; F_HSP=3.47,P>0.05; F_TNF=2.71,P>0.05。P组：F_ALT=1.53,P>0.05; F_HSP=1.84,P>0.05; F_TNF=2.36,P>0.05)。I/R各组大鼠血浆ALT、HSP72和TNF-α含量均显著高于N组与P组(F_ALT=13.42,P < 0.01; F_HSP=17.27,P < 0.01; F_TNF=15.43,P < 0.01)。I/R组中，A组血浆ALT、HSP72和TNF-α含量显著高于B、C、D组(F_ALT=13.42,P < 0.01; F_HSP=17.27,P < 0.01; F_TNF=15.43,P < 0.01)；B、C组间三指标差异无统计学意义(F_ALT=1.64,P>0.05; F_HSP=2.27,P>0.05; F_TNF=1.51,P>0.05)；D组三指标显著低于A、B、C组(F_ALT=24.12,P < 0.01; F_HSP=37.26,P < 0.01; F_TNF=25.03,P < 0.01)。见表 1。

各组大鼠肝组织均有一定的HSP72 mRNA及蛋白表达(图 2)。N组、P组各实验组大鼠肝组织HSP72 mRNA及蛋白表达差异无统计学意义(F_mRNA=2.31，P>0.05；F_蛋白=1.68，P>0.05)，但均显著低于其余各组(F_mRNA=17.24，P < 0.01；F_蛋白=14.37，P < 0.01)；I/R A组大鼠肝组织HSP72 mRNA及蛋白表达显著高于其余各组(F_mRNA=22.09，P < 0.01；F_蛋白=31.25，P < 0.01)；大鼠在缺血-再灌注前注入HSP72siRNA后(B组、C组、D组)，其肝组织HSP72 mRNA及蛋白表达均显著低于I/R A组及N组、P组(F_mRNA=9.73，P < 0.01；F_蛋白=11.08，P < 0.01)，尤其I/R D组经超声照射后其肝组织HSP72 mRNA及蛋白表达更为减少。

N：非手术组大鼠220 μL生理盐水处理后；P：假手术组大鼠220 μL生理盐水处理后；A：I/R组大鼠220 μL生理盐水处理后；B：I/R组大鼠20 μL HSP72 siRNA质粒+200 μL生理盐水；C：I/R组大鼠20 μL HSP72 siRNA质粒+200 μL超声微泡造影剂；D：I/R组大鼠20 μL HSP72 siRNA质粒+200 μL超声微泡造影剂+机械指数1.0超声波照射靶区域 图 2 各组大鼠肝组织HSP72 mRNA及蛋白表达

图选项

肝缺血-再灌注损伤是一个多因素形成的复杂的病理生理过程，微循环衰竭，氧自由基爆发性形成、中性粒细胞浸润等在其早期发病机制中具有重要意义，并决定最终肝组织的损伤程度^{[4, 5]}。本实验结果表明，单纯的缺血-再灌注后，大鼠肝功能明显受损，组织病理提示肝细胞出现片状空泡样变性及点状、片状坏死，局部肝窦内红细胞淤积、微血栓形成，微循环受损，肝窦内及穿过肝窦内皮细胞到达肝细胞周围的中性粒细胞浸润明显增多。

目前认为，缺血-再灌注肝损伤中存在典型的非感染性炎症，缺血-再灌注损伤中释放的内源性配体(如热休克蛋白)启动的Toll样受体介导的炎性应答可能是其主要作用机制^{[6, 7]}，抑制或阻断Toll样受体炎性信号通路可能有助于减弱缺血-再灌注炎性损伤。本实验在缺血-再灌注大鼠中检测到肝组织细胞HSP72 mRNA及蛋白表达升高的同时，其外周血中HSP72及肝细胞受损指标ALT与致炎细胞因子TNF-α^{[8, 9]}含量亦明显升高，提示缺血-再灌注在诱导肝组织HSP72表达升高的同时启动了肝组织细胞的炎性损伤。笔者在其他相关实验中证实，HPS72可以作为内源性配体启动Toll受体4介导的炎性应答而参与缺血-再灌注炎性损伤^[1]。

由于小分子干扰RNA(siRNA)技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达^[10]，因此，通过HSP72 siRNA抑制肝组织细胞HSP72表达可能有助于抑制或阻断HSP72介导的Toll样受体炎性信号通路而减弱缺血-再灌注炎性损伤。目前基因转染一般采用病毒或非病毒载体。以病毒作为载体，基因转染率较高，但其安全性一直是人们关注的问题，同时机体对病毒的免疫反应也是一个难以克服的难题；以质粒、脂质体等非病毒载体方法虽避免了上述缺点，但其转染效率很低。采用静脉注射的方法缺乏靶向性，局部注射又存在适用范围受限、有创等缺点。有研究认为^{[11, 12]}，超声微泡造影剂可作为一种安全、简便、高效、具有一定靶向性的体内基因转染新方法。

本实验中，大鼠缺血-再灌注损伤前若注入重组HSP72siRNA质粒，则肝组织细胞表达HSP72 mRNA及蛋白表达明显减少，血浆HSP72、ALT与TNF-α含量亦明显减低，提示重组HSP72siRNA能在体内一定程度抑制缺血-再灌注后肝组织HSP72 mRNA及蛋白的表达。由于体内质粒转染效率的不理想，本研究把重组HSP72siRNA质粒与超声微泡造影剂结合后再注入大鼠，并于大鼠肝脏局部予以一定的超声波照射后，之后给大鼠行缺血-再灌注手术。结果表明，与单纯质粒注射，或质粒与超声微泡造影剂结合后大鼠肝脏部位不行超声照射组相比，与超声微泡造影剂结合后再行超声照射组大鼠肝组织细胞损伤明显减弱，其HSP72 mRNA、蛋白表达及血浆HSP72、ALT与TNF-α含量却更为减低。

因此，HSP72 siRNA能在肝组织表达，且HSP72 siRNA与微泡结合后经超声肝组织定向照射后HSP72 siRNA在肝组织表达更为丰富，而HSP72 mRNA及蛋白表达减少，肝组织损伤明显减弱，提示超声微泡结合靶基因经一定强度超声照射后能增强靶基因转染效率，且所构建的HSP72 siRNA靶基因能静默HSP72 mRNA表达，从而一定程度上减弱HSP72作为内源性配体启动的Toll样受体介导的炎性应答^[13]，这为临床上超声介入结合基因治疗缺血-再灌注等炎性损伤性疾病提供一定的现实意义。