100101 北京,军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京蛋白质组研究中心,蛋白质组学国家重点实验室(周钢桥、王志富、翟芸);
100101 北京,解放军第306医院特种医学实验中心(岳茂兴、冯凯);
213002 江苏省常州,江苏大学附属常州市武进人民医院急诊科(郑琦涵)、普外科(史卫海)
State Key Laboratory of Proteomics, Beijing Proteome Research Center, Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing 100101, China(Zhou GQ,Wang ZF,Zhai Y);
Center for Special Medicine and Experimental Research, 306th Hospital of PLA, Beijing 100101, China(Yue MX,Feng K);Department of Emergency, Wujin Hospital Affiliated to Jiangsu University, Changzhou 213002, China(Zheng QH);
Center of General Surgery, Wujin Hospital Affiliated to Jiangsu University, Changzhou 213002, China(Shi WH)
脓毒症(sepsis)是严重战创伤、烧伤、休克、大手术后感染等常见的并发症,是当前危重症患者死亡的主要原因[1]。尽管随着医疗水平的不断提高,危重症患者的救治有了很大进步,但严重脓毒症和脓毒症休克的发病率、病死率仍居高不下[2, 3, 4]。随着对脓毒症病理生理、发病机制的研究深入[5],目前认为除了致病菌毒力等环境因素外,遗传因素在脓毒症的发生、发展中起着关键作用[6]。
非特异炎症反应是脓毒症发生、发展的关键因素[7, 8]。IL-33是孤儿受体ST2(IL-1RL1)的配体,属于IL-1家族,具有抑制和促进炎症的双重作用。现已证实,IL-33/ST2信号通路涉及哮喘、感染和心血管等疾病的发病机制[9, 10, 11]。IL-33可以通过抑制由TLRs介导的GRK2(G蛋白偶联受体激酶2)的表达,进一步阻止CXCR2表达的下调,从而增强脓毒症时中性粒细胞的募集能力[12, 13]。
现已发现IL-33单核苷酸多态性与多种疾病相关联,如强直性脊柱炎[14]、冠心病[15]、哮喘[16]等,国内有研究报道,血浆IL-33水平与脓毒症严重程度有关[17]。由此,笔者推断,IL-33基因多态性可能是脓毒症的候选易感基因,而目前国内外尚无相关研究报道。本研究通过中国汉族人群病例-对照的研究,探索IL-33基因多态性与中国人群脓毒症易感性和严重程度的关系。
1 资料与方法 1.1 一般资料在2006年5月至2010年3月在江苏大学附属武进医院急诊科和ICU共招募了280例脓毒症患者。经过民族、性别和年龄因素匹配后,从同时期当地社区健康体检的志愿者中招募了224例个体作为对照组。所有受试人员和家属均签订了知情同意书。本研究获得了江苏大学医学伦理委员会和解放军306医院伦理委员会的批准。脓毒症的诊断参照美国胸科医师协会—美国危重病医学会(ACCP-SCCM)诊断标准 [18]。
将脓毒症按严重程度的划分为脓毒症、严重脓毒症、脓毒症休克、多器官功能障碍综合征、死亡。对所有患者住院期间密切观察,直至患者出院或死亡。笔者收集了所有病例组和对照组的社会人口学资料和临床信息,如性别、年龄、出生地、吸烟和饮酒情况、医疗时慢性病状况、脓毒症的发病原因、感染部位、病原微生物培养结果、脓毒症并发症、每日的生理和实验室检查结果。在患者入院后的24 h内,利用急性生理和慢性健康评分系统(acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ,APACHE Ⅱ)对脓毒症的严重程度进行评估[19]。
1.2 研究方法 1.2.1 标签SNP的选择利用UCSC基因组浏览器(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)根据IL-33基因的位置、结构信息和表观的遗传学特点,初步确定的研究区间为:Chr9:6200000—6280000。利用HaploRegV2 (http://www.broadinstitute.org/mammals/haploreg/haploreg.php)工具获得该区间内的所有SNP信息,保留次等位基因频率(minor allele frequency,MAF)≥0.1的SNP,共得到74个。在1000genomes数据库(http://browser.1000genomes.org/index.html)中下载中国汉族人群上述74个SNP的详细数据,并用Haploview 4.2进行连锁不平衡(linkage disequilibrium,LD)构图,并进行tagSNP的选择(r2>0.8,MAF>0.1,PH-W≥0.05)。最终,7个SNPs入选最终的分型,分别是rs1891385、rs16924159、rs10118795、rs7849201、rs76864631、rs2210463和rs72614079(图 1)。
1.2.2 血细胞DNA提取采集受试者外周血5 mL,EDTA抗凝,应用酚-氯仿法提取基因组DNA,稀释成终浓度为10 ng/μL的工作液,加入96孔PCR板制成DNA模板,储存于-80 ℃冰箱。
1.2.3 基因型分析采用Sequenom MassARRAY (圣迭戈,美国)基因分型技术平台对挑选出的7个tagSNP:rs1891385、rs16924159、rs10118795、rs7849201、rs76864631、rs2210463、rs72614079进行分型。根据SNP位点通过Sequenom公司的Assay Design 3.1软件进行引物设计(表 1)。
SNP位点 | PCR引物 | 延伸引物 | 引物相对分子质量 | 延伸碱基-1 | 延伸后相对分子质量-1 | 延伸碱基-2 | 延伸后相对分子质量-2 |
rs72614079 | F:ACGTTGGATGTTCTGCCCCCTCCATGAAAC | CCACGATCCCATCTCTTAACA | 7 522.9 | G | 7 770.1 | A | 7 850 |
R:ACGTTGGATGCCTGCGCTACAGAGCAAGAT | |||||||
rs1891385 | F:ACGTTGGATGCCTGACCCTGGACTTTAATC | TGAGACAGTGGGATTTG | 5 305.5 | C | 5 552.6 | A | 5 576.7 |
R:ACGTTGGATGAGCACCTCTGTGAGGTAAAT | |||||||
rs2210463 | F:ACGTTGGATGTGTCATTAGGCCCATTCCAC | AAACGTCTATCACCCTCCTTACA | 6 887.5 | A | 7 158.7 | G | 7 174.7 |
R:ACGTTGGATGCTCTAGCTTGACTACCACTG | |||||||
rs16924159 | F:ACGTTGGATGACTTTCCAGCTGGCCTGTG | GTTCAGTCACACTCT | 5 755.8 | A | 6 027 | G | 6 043 |
R:ACGTTGGATGCAAAGTATGTGAGGCATGGG | |||||||
rs10118795 | F:ACGTTGGATGGTGGTCAGTAACGACCTACG | TGGTGAGTCTAGGTGAGT | 6 878.5 | C | 7 125.7 | T | 7 205.6 |
R:ACGTTGGATGGCTTGCAGGACTGGTG | |||||||
rs76864631 | F:ACGTTGGATGAACCCAGTCTCTTGATAACC | GAGATTACTGCTGTTATCATGG | 6 780.4 | A | 7 051.6 | G | 7 067.6 |
R:ACGTTGGATGGAGGTCGGATCTTTAAGATG | |||||||
rs7849201 | F:ACGTTGGATGATAAGGACTGCCATGGTTTG | ACCTCTTAATACTATCGCA | 5 706.7 | T | 5 978 | C | 5 994 |
R:ACGTTGGATGAGCCGGTTCCACCTCTTAAT |
Sequenom MassARRAY SNP检测过程结合多重PCR 技术、MassARRAY iPLEX单碱基延伸技术和基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析技术(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight,MALDI-TOF)进行分型检测[20]。
本实验的检测结果中,病例组检出率为99.0%,对照组的检出率为97.2%。随机选用2个样本作为阳性质控品,去离子水作为阴性质控品。对质控品进行再次检测,所得检测结果符合预期,即阳性质控品的检测结果一致,而阴性质控品无检测结果或仅有少数几个检测结果。
1.3 统计学方法计数每个SNP位点的基因型和等位基因,采用χ2检验评估对照组各基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。基因-疾病关联分析采用非条件logistic回归模型,计算共显性、显性、隐性遗传模式logistic回归模型,计算共显性、显性、隐性遗传模式下的比值比(odds ratio,OR)及95 %置信区间(confidential intervals,CI),并采用Logistic回归模型进行基因-性别交互作用分析,单体型与脓毒症的关联分析采用χ2检验计算比值比(odds ratio,OR)及95%置信区间。以上遗传学统计均利用SNPstats[21]在线关联研究工具(http://bioinfo.iconcologia.net/SNPstats)进行分析。使用在线软件SNPSpD[22](http://gump.qimr.edu.au/general/daleN/SNPSpD)计算多重检验校正系数。本研究P<0.012 5(0.05/4,校正系数为4)为具有统计学意义。一般资料中的连续变量,采用独立样本的Student’ s t检验,分类变量采用χ2检验,所有统计均是双侧检验,t检验和χ2检验使用统计软件IBM SPSS 22.0(Chicago,IL,USA)。 Power计算采用PS(Power and Sample Size Circulations)3.1软件(http://biostat.mc.vanderbilt.edu/PowerSampleSize)计算。
2 结果 2.1 脓毒症病例及对照人群的社会人口学和临床特征在病例组和对照组间,性别、年龄、吸烟、饮酒等方面的分布差异无统计学意义。本研究纳入的脓毒症患者的APACHEⅡ为(11.8±6.1),病情发展阶段主要集中在严重脓毒症(24.6 %)和脓毒症休克(23.2 %)的阶段。在脓毒症的发病原因方面,主要原因为危重病(98.2%)引起的,胸腹部(96.4%)是主要感染部位。在进行细菌培养的105例患者中,革兰阴性菌和混合细菌感染是主要的微生物感染类型,见表 2。
变量 | 病例组(n=280) | 对照组(n=224) | P值 | |||
性别(例,%) | ||||||
男 | 172(61.4) | 129(57.6) | 0.41a | |||
女 | 108(38.6) | 95(42.4) | ||||
年龄,岁(x±s) | 55.8±20.7 | 52.7±15.3 | 0.06b | |||
吸烟状态 (例,%) | ||||||
吸烟者 | 92(32.9) | 57(25.4) | 0.08a | |||
不吸烟者 | 188(67.1) | 167(74.6) | ||||
饮酒状态 (例,%) | ||||||
饮酒者 | 27(9.6) | 25(11.2) | 0.66a | |||
不饮酒者 | 253(90.4) | 199(88.8) | ||||
有慢性病者 (例,%)c | 112(40.0) | 77(34.4) | 0.23a | |||
脓毒症病因 (例,%) | ||||||
创伤 | 5(1.8) | — | ||||
危重病d | 275(98.2) | |||||
感染部位 (n,%) | — | |||||
腹部 | 173(61.8) | |||||
胸部 | 97(34.6) | |||||
其他e | 8(2.9) | |||||
联合f | 2(0.7) | |||||
微生物培养情况,No. (%) | — | |||||
未培养 | 175(62.5) | |||||
已培养 | 105(37.5) | |||||
无微生物生长 | 13(4.6) | |||||
有微生物生长 | 92(32.9) | |||||
革兰氏阴性菌 | 35(12.5) | |||||
革兰氏阳性菌 | 9(3.2) | |||||
真菌 | 5(1.8) | |||||
混合微生物g | 43(15.4) | — | ||||
APACHEⅡ评分(x±s) | 11.8±6.1 | — | ||||
疾病严重程度分级 (n,%)h | ||||||
脓毒症 | 280(100.0) | |||||
严重脓毒症 | 69(24.6) | |||||
脓毒性休克 | 65(23.2) | |||||
多器官功能障碍 | 48(17.1) | |||||
死亡 | 12(4.3) | |||||
器官功能障碍数量 (n,%) | — | |||||
0 | 211(75.4) | |||||
1 | 21(7.5) | |||||
2 | 15(5.4) | |||||
3 | 5(1.8) | |||||
≥4 | 28(10.0) | |||||
注:APACHEⅡ: Acute Physiology and Chronic Health Evaluation Ⅱ;aFisher精确检验;b独立样本t检验;c慢性病包括糖尿病、高血压、高脂血症、心脏病、肝病、肾病、慢性阻塞性肺病和慢性炎症;d危重病包括肺感染、肠穿孔、肠梗阻、肠瘘、肠破裂、腹膜炎、腹腔脓肿阑炎、胆囊炎、胆管炎、胆总管结石、肝脓肿、胰腺炎、皮下脓肿、泌尿系感染、卵巢脓肿破裂、颅内感染、糖尿病酮症酸中毒、丹毒、烧伤后感染、坏疽和中毒;e其他包括尿路、血液、皮肤、脑部、四肢;f联合指同时具有两个以上部位发生感染,包括腹部、胸部、头部和四肢感染;g混合微生物指同时感染两种以上致病微生物,包括革兰阳性、革兰阴性菌和真菌;h脓毒性休克、多器官功能障碍和死亡亚组之间有重叠,因此本组总计人数均大于相应的病例总数 |
在所选的7个SNPs中,除对照组中rs76864631(P=0.036),其余SNP在病例组和对照组中均满足Hardy-Weinberg平衡定律。校正了年龄、性别、吸烟、饮酒和慢性病状态等混杂因素后,rs10118795、rs16924159、rs1891385、rs2210463、rs72614079、rs7849201各基因型频率在脓毒症组与对照组之间,于各种遗传模型下差异无统计学意义(表 3)。将脓毒症组按休克和非休克、死亡和存活以及是否发生器官功能障碍分层后,经校正性别、年龄、吸烟、饮酒、慢病状态等混杂因素后,上述SNP与休克、死亡和器官功能障碍的发生均无明显相关性(数据未列出)。
SNP | 模式 | 基因型 | 对照组[n(%)] | 病例组 [n(%)] | OR (95% CI) | P值 |
rs10118795 | 共显性 | C/C | 73 (33.2) | 86 (30.8) | 1 | 0.8 |
C/T | 112 (50.9) | 150 (53.8) | 1.15 (0.77~1.71) | |||
T/T | 35 (15.9) | 43 (15.4) | 1.07 (0.62~1.86) | |||
显性 | C/C | 73 (33.2) | 86 (30.8) | 1 | 0.54 | |
C/T-T/T | 147 (66.8) | 193 (69.2) | 1.13 (0.77~1.65) | |||
隐性 | C/C-C/T | 185 (84.1) | 236 (84.6) | 1 | 0.95 | |
T/T | 35 (15.9) | 43 (15.4) | 0.98 (0.60~1.61) | |||
rs16924159 | 共显性 | G/G | 99 (46.5) | 145 (52.2) | 1 | 0.32 |
A/G | 98 (46) | 109 (39.2) | 0.76 (0.52~1.10) | |||
A/A | 16 (7.5) | 24 (8.6) | 1.01 (0.51~2.00) | |||
显性 | G/G | 99 (46.5) | 145 (52.2) | 1 | 0.2 | |
A/G-A/A | 114 (53.5) | 133 (47.8) | 0.79 (0.55~1.14) | |||
隐性 | G/G-A/G | 197 (92.5) | 254 (91.4) | 1 | 0.7 | |
A/A | 16 (7.5) | 24 (8.6) | 1.14 (0.59~2.22) | |||
rs1891385 | 共显性 | A/A | 112 (51.6) | 139 (50.2) | 1 | 0.91 |
C/A | 89 (41) | 114 (41.2) | 1.04 (0.72~1.52) | |||
C/C | 16 (7.4) | 24 (8.7) | 1.16 (0.58~2.31) | |||
显性 | A/A | 112 (51.6) | 139 (50.2) | 1 | 0.75 | |
C/A-C/C | 105 (48.4) | 138 (49.8) | 1.06 (0.74~1.52) | |||
隐性 | A/A-C/A | 201 (92.6) | 253 (91.3) | 1 | 0.7 | |
C/C | 16 (7.4) | 24 (8.7) | 1.14 (0.59~2.22) | |||
rs2210463 | 共显性 | A/A | 73 (33.3) | 100 (36.1) | 1 | 0.84 |
A/G | 115 (52.5) | 137 (49.5) | 0.89 (0.60~1.32) | |||
G/G | 31 (14.2) | 40 (14.4) | 0.95 (0.54~1.67) | |||
显性 | A/A | 73 (33.3) | 100 (36.1) | 1 | 0.59 | |
A/G-G/G | 146 (66.7) | 177 (63.9) | 0.90 (0.62~1.32) | |||
隐性 | A/A-A/G | 188 (85.8) | 237 (85.6) | 1 | 0.94 | |
G/G | 31 (14.2) | 40 (14.4) | 1.02 (0.61~1.70) | |||
rs72614079 | 共显性 | A/A | 113 (51.1) | 125 (45) | 1 | 0.34 |
G/A | 83 (37.6) | 124 (44.6) | 1.31 (0.90~1.92) | |||
G/G | 25 (11.3) | 29 (10.4) | 1.00 (0.55~1.83) | |||
显性 | A/A | 113 (51.1) | 125 (45) | 1 | 0.23 | |
G/A-G/G | 108 (48.9) | 153 (55) | 1.24 (0.87~1.78) | |||
隐性 | A/A-G/A | 196 (88.7) | 249 (89.6) | 1 | 0.67 | |
G/G | 25 (11.3) | 29 (10.4) | 0.88 (0.50~1.57) | |||
rs7849201 | 共显性 | C/C | 69 (31.9) | 82 (29.7) | 1 | 0.89 |
T/C | 109 (50.5) | 146 (52.9) | 1.10 (0.73~1.66) | |||
T/T | 38 (17.6) | 48 (17.4) | 1.09 (0.63~1.86) | |||
显性 | C/C | 69 (31.9) | 82 (29.7) | 1 | 0.64 | |
T/C-T/T | 147 (68.1) | 194 (70.3) | 1.10 (0.74~1.62) | |||
隐性 | C/C-T/C | 178 (82.4) | 228 (82.6) | 1 | 0.93 | |
T/T | 38 (17.6) | 48 (17.4) | 1.02 (0.63~1.64) | |||
注:括号中显示了百分比表示的基因型频率。分型样本数目的不同是由于某些个体分型失败。所有OR值均经性别、年龄、吸烟、饮酒和慢性病状态等因素的校正 |
根据连锁不平衡数据构建IL-33基因单体型,进一步探讨其与脓毒症的发生风险及严重程度是否存在相关性。6个SNP(rs10118795 T/C,rs16924159 G/A,rs1891385 A/C,rs2210463 G/A,rs72614079 G/A,rs7849201 C/T)共构建出10个单体型。其中,MAF≥0.1的只有TGAGAT(33.7 %)、CGCAGC(24.8 %)、CC(20.7 %)。校正性别、年龄、吸烟、饮酒、慢性病状态等混杂因素后,IL-33基因单体型与脓毒症的发生风险(表 4)无关,与休克、死亡和MODS的发生风险也均无明显相关性。
单体型 | 对照组分布频率 | 病例组分布频率 | OR (95% CI) | P值 |
TGAGAT | 0.338 | 0.3383 | 1 | --- |
CGCAGC | 0.2368 | 0.259 | 1.08 (0.77 ~1.52) | 0.66 |
CC | 0.2164 | 0.2007 | 0.96 (0.66 ~1.39) | 0.82 |
CGCAAC | 0.0331 | 0.0285 | 0.90 (0.40 ~ 2.01) | 0.8 |
CGAAAC | 0.0216 | 0.0302 | 1.39 (0.56 ~3.45) | 0.48 |
TT | 0.0209 | 0.0252 | 1.21 (0.52 ~ 2.85) | 0.66 |
TGAGGT | 0.0183 | 0.0245 | 1.51 (0.54 ~4.19) | 0.43 |
CT | 0.0189 | 0.0147 | 0.89 (0.30 ~2.63) | 0.84 |
TAAAGT | 0.0122 | 0.0177 | 1.21 (0.39 ~3.79) | 0.74 |
CGAGAC | 0.0146 | 0.011 | 0.71 (0.21 ~2.39) | 0.58 |
其他 | NA | NA | 0.68 (0.36 ~1.28) | 0.23 |
注:单体型从左到右依次是rs10118795 C/T;rs16924159 G/A;rs1891385 A/C;rs2210463 A/G;rs72614079 A/G;rs7849201 C/T;NA:未计算 |
本研究选取了280例脓毒症患者和224例健康个体进行了IL-33基因多态性与脓毒症相关性的研究。在tagSNP的挑选方面,本研究运用了较HapMap样本信息更大的1000 genomes数据库,并结合了UCSC基因组浏览器的基因结构精确注释,着重选取了转录因子结合位点区域或邻近的SNP,以便可以直接关联到功能SNP。统计学处理方面进行了多重检验校正,最大程度地避免假阳性的发生。本研究中,所选的7个SNP中只有rs76864631不符合Hardy-Weinberg平衡定律,故未纳入关联研究的分析。其余6个SNP基因型在脓毒症组和正常对照组中、脓毒症严重程度亚组中的分布,其差异无统计学意义,提示IL-33基因多态性可能与脓毒症的发生、发展无明显相关性。在进行易感性分析时发现rs72614079 GA杂合基因型在共显模式下与性别存在交互作用(OR=2.05,95 %CI: 1.25~3.38,P=0.015),即携带该基因型的男性个体容易发生脓毒症。但该P值略大于进行多重检验校正后的0.012 5统计标准,上述相关性值得今后扩大样本进一步跟踪。
阴性结果的解释有以下几个方面。首先,IL-33基因多态性可能与脓毒症的发生和发展无关。脓毒症的发生、发展受多个微基因效应及病原微生物等环境因素的影响,其中存在基因-基因、基因-环境间的相互作用,可能与其他候选基因密切相关[23]。有学者发现IL-1Rap的rs4624606、rs10513854多态位点分别与心肌梗死[24]、哮喘[25]相关联。但本研究中未将IL33/ST2通路中的其他相关基因,如IL1RL1、ST2等作为候选基因,故是否存在其他IL33/ST2通路基因多态性与脓毒症的相关,仍需进一步研究。其次,为提高检验效能,在tagSNP的挑选方面,本研究只选取了MAF≥0.1的SNP作为研究对象,未对其他可能具有潜在生物学功能的SNP进行研究。故不排除其他未进行研究的IL-33基因多态位点可能会影响脓毒症的发生、发展。Latiano等报道,在一个意大利人群中IL-33的rs3939286与特发性失迟缓症相关联,但该位点在亚洲人群的分布仅为0.03,远低于欧洲人群中的0.24[26]。另外,在检验效能方面,本研究的样本量和SNP的基因型分布频率,对OR值大于1.5的基因型的检验把握度(power)达到80%以上,而对于OR值小于1.5风险因子发现能力较弱。因此,要进一步确认IL-33多态性与脓毒症的关联性,未来需要更大样本量、选择更多tagSNP的病例-对照研究。
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