脓毒症是由感染所引起的全身炎症反应综合征^[1]，可导致多脏器功能不全综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，病死率高达30%～70%，是ICU病房患者死亡的最主要原因之一^[2]。虽然近年治疗措施取得显著进展，但脓毒症和MODS患者的病死率仍居高不下^[3]。研究表明脓毒症后期机体进入一个长期的免疫抑制阶段，表现为大量淋巴细胞凋亡和免疫无反应性 ^[4]，是造成患者死亡的关键。虽然脓毒症时淋巴细胞大量凋亡已成为共识，但其确切的机制及其他关键参与元素需要进一步明确。Mitofusion2是调节线粒体融合/分裂的关键蛋白之一，在维持线粒体正常形态和功能中起重要作用，而线粒体功能正常与否直接影响细胞的数量以及功能。笔者前期体外研究证实，脓毒症时Mfn2表达减少，T淋巴细胞凋亡增加，过表达Mfn2可以抑制T淋巴细胞凋亡^[5]。因此，笔者推测Mfn2在细胞凋亡过程中起重要作用。

姜黄素是从姜科植物姜黄中提取的一种色素，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种生理学和药理学活性^{[6, 7, 8, 9, 10]}。不少研究证实姜黄素对LPS诱导的脓毒症器官损害具有明显保护作用，并提高其生存率^{[11, 12, 13]}。但其作用靶点及确切机制尚不十分清楚。笔者前期研究发现，姜黄素可有效抑制脓毒症小鼠淋巴细胞线粒体途径凋亡^[14]。本实验进一步探讨了姜黄素抑制线粒体途径淋巴细胞凋亡的机制，为脓毒症防治提供新认识。

线粒体提取试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒、TUNEL试剂盒(碧云天生物技术研究所，上海，中国);灌胃用姜黄素(sigma公司，加拿大，美国)；凋亡试剂盒(BD公司，圣地亚哥，美国)；小鼠脏器组织淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，天津，中国)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(Thermo Scientific公司，马萨诸塞州，美国)；兔抗小鼠Mfn2单抗(abcam公司，剑桥，英国)兔抗小鼠Bax、Bcl-2、β-actin单抗(Cell Signaling Technology公司，波士顿，美国)；兔抗小鼠COX-4单抗(Bioworld公司，南京，中国)；山羊抗兔二抗(Cell Signaling Technology公司，波士顿，美国)。

清洁级6～8周龄BALB/c雄性小鼠45只，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，生产许可证号：SCXK(沪)2012-0002。小鼠饲养及动物实验在温州医科大学实验动物中心进行，使用许可证号：SYXK (浙)2015-0009。将小鼠随机(随机数字法)分成3组，即假手术组、脓毒症组、姜黄素组，每组15只。术前8 h禁食，自由饮水。用4%水合氯醛将小鼠麻醉成功后，于腹白线处作长约1 cm切口，游离肠系膜和盲肠末端，于盲肠游离端至根部约1/2处结扎，在盲端部位用21号针头穿刺盲肠，使肠内容物自穿刺孔少量溢出，还纳肠管，逐层缝合关闭腹腔。术毕立即皮下注射预热的生理盐水1 mL复苏。假手术组除不结扎和穿刺盲肠外，其余同脓毒症组。姜黄素组术前1周每日灌胃姜黄素200 mg/kg，脓毒症组及假手术组给予等体积生理盐水灌胃1周。

经过不同处理的小鼠在造模后24 h处死，分别无菌留取小鼠脾脏，置于盛有不含血清的RPMI-1640不完全培养液的平皿中，在400目滤网上用注射器针芯研磨，收集滤网下细胞悬液离心弃上清，加入PBS重悬。将细胞悬液缓慢加入淋巴细胞分离液液面上，24 ℃、3 000r/min离心15 min，吸取第二层低密度细胞，离心洗涤两次(1 000 r/min离心5 min)，获得脾脏淋巴细胞悬液，台盼蓝检测细胞活力达到95%以上，可以用于后续实验。

AnnexinV-FITC法：悬浮细胞离心(1 000 r/min离心5 min)收集，用PBS洗涤细胞两次(1 000 r/min离心5 min)，收集(1～5)×10⁵细胞；加入500 μL的Binding Buffer悬浮细胞，再相继加入5 μL AnnexinV-FITC和5 μL PI混匀后室温、避光反应5～15 min，1 h内上流式细胞仪检测。

采用TUNEL法按试剂盒说明操作进行。将提取的小鼠T淋巴细胞用4%多聚甲醛固定，蛋白酶K消化5 min，PBS清洗2～3次，用滤纸吸干载玻片上样本周围的液体，每片加100 μL 1×Equilibration Buffer使其覆盖待检样本区域，室温孵育10～30 min，吸干载玻片上样本周围的Equilibration Buffer，每片加50 μL TdT孵育缓冲液，室温避光反应1 h,PBS洗涤3×5 min，滤纸吸干样本周围及背面的液体，在黑暗中将载玻片浸入装有用PBS新鲜配制的浓度为2 μg/mL的DAPI溶液的染色缸中孵育5 min，PBS洗涤3×5 min,滤纸吸干样本周围的液体，立即在荧光显微镜下分析样本(用标准的荧光过滤装置在620 nm下观察BrightRed的红色荧光，或在460 nm观察蓝色的DAPI，DAPI能将凋亡和未凋亡的细胞都染成蓝色，只在凋亡的细胞核中才有BrightRed掺入而定位的红色荧光)。

按照JC-1说明书配制好染色工作液和染色缓冲液备用(染色缓冲液冰浴保存)。取(1.0～6.0)×10⁵细胞，重悬于0.5 mL 细胞培养液中，加入0.5 mL JC-1染色工作液，颠倒数次混匀，细胞培养箱中37℃孵育20 min。37 ℃孵育结束后，600 g 4 ℃离心3～4 min，沉淀细胞，弃上清。用JC-1染色缓冲液(1×)洗涤2次(加入1 mL JC-1染色缓冲液(1×)重悬细胞，600 g 4℃离心3～4 min，沉淀细胞，弃上清。再加入1 mL JC-1染色缓冲液(1×)重悬细胞，600 g 4 ℃离心3～4 min，沉淀细胞，弃上清。再用适量JC-1染色缓冲液(1×)重悬后，用流式细胞仪分析。

按照细胞线粒体分离试剂盒说明书操作。用预冷的PBS洗涤淋巴细胞，离心弃上清，按照(2～5)×10⁷细胞中加入1～2.5 mL的线粒体分离试剂(临用前需添加PMSF)重悬细胞，冰浴15 min，用研杵研磨细胞30～40次，将细胞匀浆物转移到EP管，4 ℃600 g离心10 min，收集上清液；将上清液转移到新的离心管，4 ℃11 000 r/min离心10 min，离心后的上清含胞浆成分，将上清转移到新EP管，线粒体沉淀在管底；在线粒体沉淀中，加入添加了PMSF的线粒体裂解液，裂解线粒体膜，4 ℃孵育5 min，然后12 000 r/min，离心10 min，取上清液作为线粒体内的蛋白成分；分离线粒体过程中，留取的上清液4 ℃12 000 g离心10 min，取上清即为胞浆蛋白。

将分离得到的总蛋白、胞浆蛋白与线粒体蛋白，采用BCA法检测蛋白浓度，制备上样缓冲液，蛋白上样量为30 μg。用Image Lab软件对条带进行分析，计算出吸光度值，用目标带分别与内参照β-actin(总蛋白、胞浆蛋白)与COX 4(线粒体蛋白)的吸光度比值来衡量表达情况，作为Mfn2、Bcl-2与Bax蛋白的相对表达量。

计量资料以均数±标准差(x±s)表示，应用SPSS 18.0统计软件进行分析处理，计数资料采用χ²检验，计量资料组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

小鼠病死率比较采用χ²检验，假手术组小鼠术后24 h无死亡，脓毒症组小鼠术后24 h病死率为46.7％，姜黄素组小鼠术后24 h病死率为40%。姜黄素组病死率明显低于脓毒症组(χ²=6.429，P=0.01)。

流式细胞术检测脾淋巴细胞凋亡，3组比较(F=35.085，P<0.01)，差异具有统计学意义。进一步两两比较，脓毒症组淋巴细胞凋亡细胞比率(17.10±1.67)％与假手术组(9.43±1.06)％比较明显增加(P<0.01)，差异具有统计学意义；与脓毒症组相比，姜黄素组淋巴细胞凋亡率(12.70±1.25)％明显降低(P=0.012)，差异具有统计学意义；姜黄素组淋巴细胞凋亡率明显低于假手术组(P=0.003)，差异具有统计学意义。(见图 1A和图 1B)。TUNEL法检测脾淋巴细胞凋亡，脓毒症组淋巴细胞凋亡较假手术组明显增加，姜黄素能明显降低脓毒症组的淋巴细胞凋亡(见图 2)。

与假手术组比较，aP<0.01；与脓毒症组比较，bP<0.05 各组取右下象限来比较各组间的凋亡差异 图 1 流式细胞术Annexin V/PI双染法检测淋巴细胞凋亡 Fig 1 Lymphocytes apoptosis detected using Annexin V/PI staining by flowcytometry

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图 2 TUNEL法检测淋巴细胞凋亡 Fig 2 Lymphocytes apoptosis detected using TUNEL

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淋巴细胞经JC-1染色后流式细胞仪检测，3组比较F=52.666，P<0.01，差异具有统计学意义。进一步两两比较，脓毒症组小鼠淋巴细胞线粒体膜电位降低率明显高于假手术组[(45.13±4.14)％vs.(21.63±1.62)％，P<0.01]，差异具有统计学意义，而姜黄素组线粒体膜电位降低率为(29.67±2.15)％，明显低于脓毒症组(P=0.001)，差异具有统计学意义；姜黄素组线粒体膜电位明显低于假手术组(P=0.001)，差异具有统计学意义(见图 3A和图 3B)。

与假手术组比较，aP<0.01；与脓毒症组比较，bP<0.01 图 3 流式细胞术检测线粒体膜电位水平 Fig 3 Mitochondrial membrane potential detected by flow cytometry

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检测3组细胞总Bcl-2蛋白( F=26.555，P=0.001)、Mfn2蛋白( F=147.122，P<0.01)，差异具有统计学意义。进一步两两比较，与假手术组相比，脓毒症组淋巴细胞Bcl-2蛋白(P=0.01)、Mfn2蛋白(P=0.015)水平明显下调，差异具有统计学意义，而姜黄素组其Bcl-2蛋白(P=0.001)、Mfn2蛋白(P=0.002)水平明显升高，差异具有统计学意义(见图 4A和图 4B)；假手术组和姜黄素组Bcl-2蛋白(P=0.146)、Mfn2蛋白(P=0.941)，差异无统计学意义；3组细胞分离线粒体蛋白(F=401.556，P<0.01)和胞浆蛋白(F=355.092，P<0.01)检测，差异具有统计学意义。进一步两两比较，脓毒症组线粒体Bax蛋白水平较假手术组明显上调(P=0.001)，差异具有统计学意义，姜黄素组可明显降低脓毒症组的Bax蛋白水平(P=0.02)，差异具有统计学意义；姜黄素组和假手术组Bax蛋白(P=0.176)，差异无统计学意义(见图 4C和图 4D)；脓毒症组胞浆Bax蛋白水平较假手术组明显降低(P<0.01)，姜黄素组胞浆Bax蛋白水平较脓毒症组明显升高(P<0.01)，姜黄素组和假手术组Bax蛋白(P<0.01)，差异具有统计学意义(见图 4E和图 4F)。

与假手术组比较，aP<0.01；与脓毒症组比较，bP<0.05 图 4 Western blot印迹检测Mfn2、Bcl-2、Bax蛋白表达水平 Fig 4 The protein expression of Mfn2, Bcl-2 and Bax detected by western blot

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脓毒症是临床常见的急危重症，进一步发展可导致脓毒性休克、多器官功能障碍综合征，具有来势凶猛、进展迅速、预后差的特点。目前脓毒症的研究虽然已取得很大进展，但脓毒症引起MODS的病理生理机制并不十分明确^[15]。淋巴细胞凋亡作为其晚期免疫抑制的重要机制之一，一直是研究的重点，但是拮抗淋巴细胞凋亡治疗并未取得较好的疗效。细胞凋亡主要通过死亡受体活化途径、线粒体途径以及内质网途径3条途径调控，其中线粒体途径在细胞凋亡过程中最为重要。因此线粒体在细胞凋亡中的作用以及线粒体靶向治疗逐渐受到关注^[16]。

线粒体是一个高度动态的细胞器，并处于不断的融合与分裂过程中。线粒体可以有长管状、网络状、椭圆形，在细胞发育、细胞周期或各种毒性条件下线粒体的数目和形态发生变化，其形态和功能的变化对细胞凋亡有重要影响^{[17, 18]}。线粒体融合不足或过度融合都会导致线粒体形态改变进而对其功能造成影响从而促进细胞凋亡，因此维持线粒体适当的融合对细胞可能起到保护作用。线粒体融合分裂蛋白是维持线粒体形态及功能的关键因素，其中Mfn2作为参与线粒体融合的重要成员之一，在该过程中起了重要作用^[19]。Mfn2是果蝇Fzol蛋白在人体的同源类似物，是线粒体融合的必需基因^[20]。大量研究证实Mfn2融合效应对细胞起到保护作用^{[21, 22, 23]}。笔者前期也有研究证实上调Mfn2的表达可以逆转由晚期炎症因子HMGB-1所引起的CD4+T淋巴细胞凋亡增加^{[5, 24]}。前期预实验发现，小鼠在CLP术后24hMfn2 蛋白的表达降低最明显，因此本研究选取CLP术后24 h为正式实验条件。本研究中应用Western blot 检测Mfn2蛋白在淋巴细胞中的表达，结果得出脓毒症组Mfn2表达水平明显低于假手术组，说明脓毒症时Mfn2表达减少。

姜黄素是从姜科植物的根茎中提取的一种天然化合物，由于其具有抗炎、抗氧化、清除自由基、抗肿瘤、抑菌等多种药理活性、毒性低而得到广泛的应用。近年来其在免疫调节中的作用越发受到关注。既往研究发现，姜黄素可以促进T淋巴细胞增殖、抑制其凋亡^[25]。笔者前期通过姜黄素200 mg/kg灌胃小鼠发现姜黄素可有效抑制脓毒症小鼠淋巴细胞线粒体途径凋亡^[14]，但其确切机制尚不十分清楚。

本研究中同样发现姜黄素可有效抑制脓毒症小鼠淋巴细胞线粒体途径凋亡。姜黄素预处理可改善脾淋巴细胞凋亡率以及线粒体膜电位降低率，使其升高；Bcl-2是凋亡抑制蛋白，本实验中应用Western blot 检测其在脾淋巴细胞的表达，结果得出脓毒症组Bcl-2蛋白表达较假手术组明显减少，说明脓毒症时淋巴细胞凋亡增加；而姜黄素预处理可使Bcl-2的表达升高，说明姜黄素可以改善脓毒症小鼠淋巴细胞凋亡，使其凋亡减少。细胞在正常状态时，Bax主要存在于胞浆中，在细胞受到凋亡刺激的情况下，胞浆中Bax蛋白转移到线粒体中。本研究中应用Western blot分别检测胞浆和线粒体中的Bax蛋白水平，结果得出脓毒症组胞浆中Bax蛋白水平降低；线粒体中Bax蛋白水平升高，说明线粒体途径在淋巴细胞凋亡中起到重要作用；而姜黄素预处理可明显降低脓毒症组线粒体中Bax蛋白水平的升高，说明姜黄素能够通过线粒体途径抑制淋巴细胞凋亡。以上实验结果都与前期研究结果相一致。本实验还发现通过Western blot 检测脾淋巴细胞Mfn2蛋白的表达，结果得出脓毒症组Mfn2较假手术组明显降低，而姜黄素预处理可明显改善脓毒症组Mfn2蛋白水平的降低，使其表达升高，说明姜黄素可通过上调Mfn2的表达抑制淋巴细胞凋亡。因此笔者推测，姜黄素抑制脓毒症小鼠脾淋巴细胞凋亡可能是通过上调Mfn2，促进线粒体融合实现的。