近二十年来的理论和实践认为脓毒症(sepsis)是由感染引起的全身炎症反应综合征,可发展为严重脓毒症(severe sepsis)和脓毒性休克(septic shock)。循证医学的发展使脓毒症的诊疗技术得到了很大的提高,基于循证医学证据制定的“拯救脓毒症运动”相关指南一定程度上降低了脓毒症的死亡率,但预期的效果不尽人意。面对脓毒症医学专家们正在对循证医学进行一些新的变革和选择。而另一方面,患者的异质性对结局带来的影响日益受到重视,力求解释相同的诊疗措施在不同的患者身上疗效为何相差甚远。随着人类全基因组测序的完成,基因组、转录组、蛋白质组和代谢组等各种组学研究也得到了迅猛发展,使得能够从分子和细胞层面来解读疾病的发生和发展。利用目前基础研究领域的大量研究成果,针对每个个体量身定制个体化的治疗方案,实现诊疗措施的精准化是未来医学发展的主要方向。2015年1月20日,美国总统奥巴马在国情咨文演讲中提出了明确和详细的“精准医学”(precision medicine)计划,这标志着现代医学在经历了传统医学和循证医学模式后,进入了精准医学时代。本文将简要阐述精准医学的基本概念及其在脓毒症研究中的应用。
1 精准医学的定义和研究内容精准医学本质上是在20 世纪70 年代提出的“个性化医疗”基础上发展起来的新型医学概念。“精准医学”一词的表述最早是2008 年哈佛大学商学院克雷頓.克里斯汀生(Clayton Christensen)提出的,用以表述分子诊断使得医生不用依赖于直觉和经验便可以明确诊断,但是当时这个表述并没有引起太多的关注。直到2011年美国国立研究委员会在发表的《迈向精准医学: 建立一个生物医学知识网络和一个新疾病分类法框架》中正式提出“精准医学”概念[1],精准医学才开始受到广泛重视。继奥巴马的“精准医学”计划后,2015年1月30日美国国立卫生研究院(NIH)和美国国家癌症研究所(NCI)主任哈罗德·瓦默斯(Harold Varmus)进一步解释了针对癌症的精准医学概念和计划内容[3]。然而,此时的精准医学已经与个性化医疗所强调为个体设计独特的治疗方式不同,精准医学是服务于疾病新分类的需求,整合生物医学研究和临床医学信息,并依据不同分子学基础定义疾病亚型,达到在分子学水平为临床疾病亚型群体提供更精确的诊断和治疗。
虽然,精准医学是近几年才提出来的新概念,但事实上在20世纪开展的根据患者血型制定不同输血方案的做法就是精准医学最早的实施案例。近年来随着生物信息数据库(人类基因组序列) 、患者个性化检测技术(如蛋白质组学、代谢组学、基因组学技术等) 和大数据分析技术的迅速发展,精准医学的理念开始更加广泛地应用。与以往医学理念相比,精准医学进步之处是将人们对疾病机制的认识与生物大数据和信息科学相结合,精确进行疾病分类及诊断,为患者(目前主要是乳腺癌、白血病) 提供更具针对性和有效性的治疗措施,既有生物大数据的整合性,也有个体化疾病诊治的针对性和实时检测的先进性[5]。
为了促使精准医学的实施,美国科学院设计了一个“模型”[1]:建立起一个共同的包含基础研究发现和临床医学研究数据的生物学信息数据库,通过搜集每例患者的基因组学、表观基因学、蛋白组学、信号传导学、临床症状体征及临床实验室检测数据,结合体内微生物学、外环境暴露学、社会学等资讯,建立个体信息港,通过大协作,建立疾病知识共享平台,在大数据的框架下寻找疾病的分子基础及驱动因素,重新分类疾病,实现精准的疾病分类及诊断,并在此基础上开展循证医学研究,对有相同病因、共同发病机制的患者亚群实现精准的评估、治疗及预防。
2 精准医学在脓毒症研究中的应用 2.1 脓毒症的基因组研究目前脓毒症的基因组学研究主要集中在基因多态性。基因多态性是决定人体对应激打击易感性与耐受性、临床表型多样性及药物治疗反应差异性的重要因素。最常见的基因多态性是单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)。编码炎症介质和病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PRRs)蛋白分子基因的SNPs是导致脓毒症患者之间的个体化差异的重要因素之一。
近年来,通过对临床脓毒症及MODS 患者重要的炎症相关因子的基因型相关分析,已经发现脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein,LBP)和杀菌通透性增加蛋白(bactericidal permeability increasingprotein,BPI)、甘露糖结合血凝素(mannose-binding lectin,MBL)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factors,TNF)、白细胞介素-1( interleukin-1,IL-1 ) 及其受体拮抗剂、IL-10 、白细胞分化抗原14(cluster of differentiation 14,CD14) 、toll样受体(toll-like receptor,TLRs)、移动抑制因子(migration inhibition factor ,MIF)、血浆Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制因子-1(plasminogen activator inhibitor-1 ,PAI-1)等均存在脓毒症相关的基因多态性,其中研究得最多的是编码TNF、MIF、PAI-1和TLR的基因[3, 4, 5, 6, 7]。
TNF的SNP研究中常见的多态性位点有-308、-376和-238,这三个位点的SNP都涉及到鸟嘌呤(G)被腺嘌呤(A)所取代,其中研究得最多的是启动子位点-308。现有的关于位点-308处SNP在脓毒症中作用的研究得出的结论并不一致。最近的一项纳入1 057例白人血统危重患者研究的研究显示,TNF位于SNP的AA纯合子较其他基因型有着更高的病死率[8]。对外科患者的研究发现,该SNP携带者更容易在严重创伤或者手术后发展为严重脓毒症[9, 10, 11]。然而,两个分别有280例和93例患者的研究未能揭示在位点-308处的A等位基因在社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia,CAP)的发展中发挥作用[12, 13]。当对213例机械通气的患者的所有3个SNPs进行分析时,发现携带至少其中的一个SNP等位基因与更早发生呼吸机相关性肺炎(ventilator associated pneumonia,VAP)和脓毒症相关[14]。一项囊括有25个研究的Meta分析显示,TNF多态性基因TNF2(-308 G/A 或者A/A)与脓毒症相关,但与死亡无关。但进行亚群分析时发现,相对于其他族群,携带这种SNP的亚洲人群有更高的风险发生脓毒症,并且死亡风险增高[15]。
TLR是一类主要识别革兰氏阳性球菌的PRR。TLR1报道的最多的SNP位点是-7202腺嘌呤-鸟嘌呤转换,+742的腺嘌呤-鸟嘌呤转换,以及+ 1804的鸟嘌呤-胸腺嘧啶位置颠换。在一组有1 498例严重创伤患者的队列研究中,-7202 的G等位基因和+1804的 T等位基因频率较小的纯合子患者死于脓毒症的风险更大(调整后的比值比分别为3.16和2.48)。这些患者死于革兰阳性球菌引起的脓毒症的风险也更大[16]。另一项研究表明,和队列中的基因携带者相比,-7202 GG和+ 742 GG基因型携带者发生感染性休克的风险更大,其血中C反应蛋白水平更高,而白细胞介素-10水平较低[17]。另外,一项纳入了493例感染性休克患者的独立队列研究也证实了TLR1的 SNPs会影响病死率[18]。
TLR4的两个非同义多态性会影响TLR4的配体结合位点Asp299Gly和 Thr399Ile的改变,而这些只发生在白人身上。在非洲人种身上发现了Asp299Gly等位基因来源的TLR4单倍体[19]。研究发现这些单倍体分布于3个大陆的15个族群,而非洲人有更高的Asp299Gly等位基因,但是印度和欧洲人则有Asp299Gly和 Thr399Ile两种等位基因[20]。在这些基因多态性的基础上,研究者将人群分为非洲,西欧亚人和东欧亚人(包含美洲人)3种。主要是由于现代人从非洲的传播,而迁徙后的进化压力驱动导致TLR4单倍体分布频率不同。这些多态性产生不同的表型,例如和拥有Asp299Gly和 Thr399Ile单倍体的白人相比,非洲人拥有Asp299Gly等位基因的会有增强的炎症反应,能抵抗疟疾侵袭。白人Asp299Gly等位基因的消失可能来源于强的TNF-α的负性选择,结果,导致面对疟疾有着较高的死亡风险。而在非洲,疟疾会造成进化压力,因此Asp299Gly等位基因虽然对疟疾具有抵抗作用,但会抑制过度激活的TNF-α。这个案例同时也表明,特异的病原体可以通过人类的进化压力来影响内源性的免疫系统。
MIF具有拮抗糖皮质激素的作用。MIF基因有两个SNPs:一个在-173位点,一个处于-794微卫星区域,两个独立的研究表明-173 CC基因型对脓毒症患者预后具有重要影响。其中一项纳入了169例严重脓毒症白种人研究表明,GG基因型患者在非肺部和腹部来源的感染中死亡风险增加(比值比3.818,P=0.006 6)[21]。另一组含有1 739例CAP患者的队列研究证实GG基因表型会导致预后不良[22]。
PAI-1主要在位点-675有一个4G/5G的SNP,该SNP与脓毒症的发生、发展和预后相关。血浆中高浓度的PAI-1与脓毒症患者的不良预后相关,在PAI-1 基因启动子区域4G /5G或4G/4G等位基因表型与血浆中较高的PAI-1 相关。Hermans 等[23] 研究了175例脑膜炎患者和226例健康对照者,结果发现4G /4G 基因型组血浆PAI-1的浓度以及脓毒症的病死率明显高于4G/ 5G 或5G/5G 基因型组。Menges 等[24] 研究了61 个创伤患者和31例健康对照者,结果发现4G/4G 基因型和较高的血浆IL-1 ,TNF-α,PAI-1 浓度相关。最近的一项荟萃分析研究了12个病例对照研究和3项队列研究,结果表明SNP会增加脓毒症的易感性,导致预后不良[25]。
值得指出的是,对感染有预防作用的某种基因表型在发生全身感染的时候可能导致病情恶化。例如,大量研究认为TNF反应可以降低感染的风险,但是会增加脓毒症休克的死亡风险。因此,在以人群为基础的研究中,改变某个宿主反应的后果可能是产生竞争性的影响[20]。
2.2 脓毒症的转录组研究基因表达谱分析采用基因芯片的方法来同时分析生物样本中成千上万个转录子的丰度,这种全基因组分析方法也被称为转录组。转录组在脓毒症研究中的应用主要涉及四个方面:从基因组水平来理解脓毒症;寻找生物标记物;基于基因表达谱对脓毒症休克进行亚分类;以及为治疗寻找新的靶标和信号通路。
转录组可以从一个更加宽广的基因组水平来理解脓毒症的发病机制。通过基因表达谱分析可以勾画出那些调节先天免疫和适应性反应以及在脓毒症发病过程中上调或下调的基因[26]。其中一个例子是利用转录组来研究脓毒症的两个反应时相:早期的SIRS和后期的CARS反应时相,目前这一两个免疫反应时相模型受到了多个临床试验的挑战。最近,Tang等对用人类脓毒症基因表达谱分析的研究结果进行了荟萃分析,其中得出的一个主要结论是,转录组数据并不能将脓毒症区分为促炎和抗炎这两个时相,这一结论虽然受到了质疑,但也得到了最近的一些临床和动物实验数据的支持[27]。转录组在脓毒症机制研究中的另一个实例是用来研究免疫麻痹的概念。免疫麻痹指的是人体的适应性免疫,在这种状态下机体无法清除感染的病原体。这一概念目前在多项临床和动物的转录组研究均得到了证实[28]
利用转录组来寻找脓毒症诊断和预后判断的生物标记物也是目前研究的方向。Johnson等[29]利用基因芯片分析全血发现,感染引起的SIRS与非感染性SIRS有着不同的基因表达谱,甚至在临床上脓毒症还不很明显的时候就已经存在这种差别。其他的研究小组发现了用于区分脓毒症和SIRS白细胞的基因标签[26, 30]。Pachot等利用基因表达谱分析发现了CX3CR1是脓毒症预后中的一个潜在生物标记物[31]。
转录组的另一个应用是基于基因表达谱分析对脓毒症休克进行亚分类。在儿科的研究中发现,一个由100个差异表达基因组成的基因标签(对应于适应性免疫、糖皮质激素受体信号、和过氧化物酶体增殖物激活受体-α信号通路的基因)可将感染性休克的儿童临床上分为相关的三亚组[31]。
目前,有研究采用转录组的方法来寻找脓毒症治疗的靶标和信号通路。例如,Pathan等[33]将多个基因表达谱数据组合到一起,发现IL-6是脑膜炎球菌脓毒症导致心肌抑制的关键蛋白。Pachot等[34]通过临床脓毒症的转录组分析,分析了生存者和死亡者的基因表达差异,并从中发现编码CX3CR1的基因在生存者中表达水平最高。接下来的验证实验也发现单核细胞CX3CR1表达失调是导致脓毒症免疫麻痹的重要机制。
然而,基因表达谱也有某种局限性,例如,在对转录组进行解释和在临床实践中将其用作脓毒症标志物时,必须分清靶器官基因表达的组间和组内变异和差异[35]。虽然基因标签可以提供一个个体在脓毒症的任何特定时间点的基因表达谱快照,它们不能囊括调节一个不断发展炎症过程的所有因素,也不能预测某个干预措施带来的反应。
2.3 脓毒症的蛋白质组学研究蛋白质组学为脓毒症的研究提供了一条新的途径。虽然基因的调控表达对疾病的发展起着一定作用,但直接的功能执行者仍是蛋白质。脓毒症是机体的免疫亢进和免疫抑制的失衡所引起的一种全身性的瀑布式炎性反应。应用蛋白质组学技术可以全面的分析出脓毒症时相关蛋白改变。有研究通过鉴定脓毒症患者血和尿中差异表达的蛋白,发现了其中潜在的诊断或预后生物标志物[36, 37]。另外,也有研究先通过蛋白质组学分析来确定新的标志物,然后用于新生儿脓毒症的前瞻性研究中,并成功地进行风险分层和指导新生儿抗生素降阶梯治疗[38]。
尽管国内外的脓毒症蛋白质组学研究虽然取得了不少成就,但目前开展的研究大都是寻找脓毒症时的蛋白差异点并进行一些简单的验证分析,而对这些脓毒症关键蛋白的功能、作用及相互联系很少有人进行深入研究。
2.4 脓毒症的代谢组学研究代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后新发展起来的一门组学技术,以一组代谢物群体作为“模式标志物”来诊断疾病,可实现脓毒症的早期诊断和诱因的早期鉴别,并采取有效的针对性治疗。脓毒症代谢组学最早确定可用于检测的生物标记物是C反应蛋白,但是其特异性不高;降钙素原比C反应蛋白特异性[39]、灵敏度更高,但是其可行度仍待研究。在最近的一项研究中,研究人员采用液相色谱-串联质谱对186种代谢物进行代谢组学分析,研究人员发现酰基肉碱和甘油这两种标记物可能有助于鉴别脓毒症和非感染性SIRS[39]。有学者利用代谢组学研究给药后脓毒症大鼠代谢物变化,来判断用药是否有效,或区分革兰阳性菌和革兰阴性菌引起的脓毒症的不同等。Lehmann 等[40]研究类固醇类药物脓毒症大鼠的代谢组学,发现代谢物指纹分析可以用于服用类固醇类药物脓毒症大鼠的生物标记物的寻找,指导类固醇类药物对脓毒症大鼠的治疗。
3 精准医学对脓毒症临床诊疗的影响为了在脓毒症的治疗中采用个性化的方法,需要能够勾画出每个脓毒症患者身上发生的复杂的宿主-病原体之间相互作用,并将这方面的知识转化为个体化治疗,以改善脓毒症患者的预后。到目前为止,已经确定了在脓毒症的某些部分进行干预可以改善预后。
3.1 早期诊断目前已经广泛认识到在入院的第一个小时内使用抗生素治疗能改善脓毒症患者的预后[41]。然而,由于传统的诊断方法,如血培养的限制,往往会导致延迟开始适当的抗菌治疗,并导致不必要的广谱抗生素组合的广泛使用。微生物学的自动化分子检测和蛋白质组学方法的进展已经让早期对血液或其它生物标本中的特异性病原体的定性和定量分析成为可能,但是,其中一些方法仍然需要在临床试验中验证。
3.2 根据基因特征制定个性化治疗方案在脓毒症中,某些宿主基因的单核苷酸多态性与预后不良相关。脓毒症患者早期基因分型可以使临床医生分流那些死亡风险高的患者早期接受重症监护支持,并且基于他们的免疫时程变化特征来确定哪些患者将从免疫干预获益。研究表明,在脓毒症发展的过程中,外周血单核细胞的TNF的一个SNP等位基因携带者会产生更大量的炎性细胞因子[14],而这类SNP的携带者在患慢性炎症性疾病的时候采用抗TNF治疗疗效不佳[42]。
另外,有几种药物可用于调节宿主的反应。其中的一些可减轻促炎反应,例如TNF-α靶向抗体和IL-1β可溶性受体拮抗剂,而另一些可刺激促炎反应,例如干扰素γ(IFN-γ)。要选择适当的免疫调节剂就需要知道患者确切的免疫反应状态。这可以通过采用转录组和蛋白质组学分析的方法来区分哪些促炎和抗炎通路上调或下调的。
3.3 生物标志物引导治疗蛋白生物标志物最常用于监测临床反应和指导治疗。一项纳入了200例VAP引起脓毒症患者的随机对照临床研究结果表明,疾病的临床症状加重与IL-10 /TNF-α比值升高相关,外周血单核细胞产生IL-6水平和单核细胞表面的CD86降低可作为开始使用克拉霉素辅助治疗的标记物[42]。由Doke等[43]开展的一项前瞻性研究也表明,在单核细胞表面HLA-DR表达小于30%的脓毒症患者采用IFN-γ100 μg/d治疗可以逆转单核细胞的免疫麻痹状态。同样,在另一个随机试验中发现粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)治疗8 d可恢复单核细胞免疫功能,并且与缩短机械通气和住院时间相关[44]。地塞米松作为CAP的辅助治疗措施能够缩短肺炎影像学改善的时间1 d。然而,绝大多数病死率分析显示只有那些IL-6,IL-8和MCP-1水平升高和降低皮质醇水平升高的患者才能从中获益[44]。一个广泛用于指导在重症监护病房抗生素降阶梯治疗或调整的生物标志物,血清降钙素原(PCT)的使用可以减少不必要的抗生素,尽管对预后的影响并不明确[45]。
总之,基因测序技术的进步使得个人基因组分析成为现实,各种组学方法的发展也使得人们能从更加广阔、深入的来理解疾病发生机制,拟定个性化的治疗方案。未来根据每个脓毒症患者的个体特异性制定个性化精准预防、精准诊断和精准治疗方案并非遥不可及。
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