急性坏死性胰腺炎(acute necrotic pancreatitis,ANP)是临床上常见的危重疾病，容易并发多器官功能障碍综合征(MODS)，其中肺脏是最常受累的胰外器官，急性胰腺炎肺损伤是SAP患者早期病死的主要原因之一^{[1, 2, 3]}，对SAP合并肺损伤早期进行药物干预治疗仍然是最近的研究热点。目前认为中性粒细胞聚集并释放的多种酶，尤其是中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)急性肺损伤的发病中起重要作用。西维来司钠(sivelestat sodium,ONO·Na)是一种特异性中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂，可在炎症局部有效抑制NE，减轻肺组织损伤并改善肺功能^[4]。信号转导与转录激活因子(STAT)是一种新型细胞内信号转导和基因表达调控因子。急性胰腺炎时释放的各种细胞因子可以通过JAK／STATs途径激活STATs而诱导目的基因的表达^[3]。本实验通过建立大鼠急性坏死性胰腺炎(ANP)肺损伤模型^[5]，并应用西维来司钠对大鼠ANP合并肺损伤进行干预处理，以探讨其对ANP合并肺损伤的保护作用及其作用机制，为其用于临床治疗重症急性胰腺炎合并肺损伤提供实验依据。

75只SPF级雄性SD大鼠，体质量200~250 g(由上海实验动物中心提供)。按随机数字法分为正常组、ANP组和ONO治疗组，每组25只。西维来司钠购自美国Sigma公司，牛磺胆酸钠购自美国Sigma公司，使用前用生理盐水配制成浓度为5%的溶液。MDA和NE检测试剂盒购自奥地利Bender Medsystems公司。TNF-α和MPO 检测试剂盒购于北京中杉生物技术有限公司。

采用胆胰管逆行注射5％牛磺胆酸钠(美国Sigma公司)0.1 mL/100 g体质量的方法制备ANP模型，可以看到透明胰胆管内张力增加，有液体进入，从胰头部开始，胰腺开始变红、水肿，面积逐渐扩大。5 min后退针，查看有无胆漏，如有则穿刺失败，没有则穿刺成功。正常组大鼠胆胰管内注入等容积生理盐水。ONO治疗组于造模后立即经阴茎静脉注射西维来司钠(10 mg/kg)体质量，其他两组注射等容积生理盐水。

各组分别于6、12及24 h时间点取腹主动脉血(肝素抗凝)4 mL立即送检动脉血氧分压，大鼠处死后留取肺组织，用于检测MPO、TNF-α、NE、MPO及STAT1蛋白和磷酸化STAT1(P-STAT1)蛋白的表达。取胰腺组织和肺组织用10%中性磷酸缓冲福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片，苏木精-伊红(HE)染色后留待光镜观察。

血清淀粉酶检测采用全自动生化分析仪，肺组织检测NE、MDA、MPO和TNF-α采用酶联免疫吸附试验(ELISA)，PaO₂检测采用全自动血气分析仪。制备肺组织匀浆，蛋白定量后常规行蛋白质印迹法检测STAT1和p-STAT1表达，用凝胶分析软件分析目的蛋白条带的相对表达量。

应用SPSS 18.0统计软件进行分析。各组计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示，组间分析采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

ANP组PaO₂各时间点较正常组和ONO组均降低(P＜0.05)。ANP组TNF-α水平在制模后6 h达高峰，以后各时间点随之下降，ONO组TNF-α对应时间点水平明显低于ANP组，差异有统计学意义(P＜0.05)。血浆淀粉酶、MPO、NE、MDA水平的变化SAP组各时间点均较正常组升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，ONO组血浆淀粉酶、MPO、NE、MDA水平均较SAP组降低(P＜0.05)。见表 1和表 2。

正常组胰腺组织均无明显异常。ANP组大鼠表现为胰腺水肿明显，可见片状出血灶，大网膜及系膜周围组织器官轻度黏连，并可见散在皂化斑，ONO治疗组与ANP组相比，胰腺病理改变均较轻,病理评分下降，病理评分与同时间点ANP组的差异有统计学意义(P＜0.05)。

正常组肺组织结构清晰，肺泡壁完整，无明显水肿和渗出，无明显病理改变。ANP组大鼠肺组织间质明显充血、水肿，细胞浸润，间质明显增宽，肺间质中性粒细胞(PMN)及单核细胞浸润，随着时间延长肺损伤加重，肺组织病理评分逐渐增高。ONO治疗组大鼠肺间质水肿减轻，炎症细胞浸润较ANP组减少，病理评分下降，病理评分与同时间点ANP组的差异有统计学意义(P＜0.05)。见图 1。

图 1 正常组(A)、ANP组(B)、ONO组(C)12 h点大鼠胰腺组织光镜下病理改变(HE×200)。NOR组(D)、ANP组(E)、ONO组(F)12 h点大鼠肺组织光镜下病理改变(HE×200)

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肺组织STAT1及p-STAT1蛋白的表达ANP组p-STAT1蛋白表达水平12 h显著高于正常组(P＜0.05)。ONO治疗组 p-STAT1蛋白在同时点均较ANP组显著下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图 2、3。

图 2 肺组织STAT1及p-STAT1蛋白的表达

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图 3 肺组织STAT1及p-STAT1蛋白的相对表达量

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急性胰腺炎是临床常见的急腹症之一，其中SAP占20％～30％，病死率高达40％。目前认为，SAP实质上亦是一种严重的全身炎症反应综合征(SIRS)，其机制是由于不同的致病因素通过引起胰腺腺泡细胞的损伤，引发中性粒细胞释放大量炎性介质导致MODS^{[6, 7, 8]}。而在胰外器官中，尤以ARDS最为突出。西维来司钠(sivelestat sodium)是一种小分子中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)抑制剂，在应用于重症急性胰腺炎肺损伤方面尚处于研究阶段，报道相对较少。本实验通过建立大鼠SAP 肺损伤模型来探讨西维来司钠对SAP 大鼠肺损伤的作用。

目前对于AP合并ALI的机制仍不完全确定，许多研究表明与多种促炎细胞因子介导的全身反应综合征有关，如TNF-α、血小板活化因子、白细胞介素等炎性介质在肺组织的积聚、活化，可能为AP并发ALI的一个重要病理机制^{[9, 10]}。细胞因子通常与细胞膜外受体结合后启动胞内信号转导系统，引起目的基因表达发生改变。这种从细胞外到细胞核的信号转导极其迅速，其中STATs信号通路是许多细胞因子的共同信号通路之一^{[11, 12]}。Janus激酶与STATs形成一种JAK-STATs复合通路，JAK-STATs通路不仅在细胞的增殖、分化、凋亡和血管发生等这些正常生理过程中起着重要的作用，亦与某些疾病的发生发展密切相关，而抑制该通路的活化能减轻炎症的病理损伤^{[13, 14]}。

研究发现胰腺腺泡细胞内存在JAK-STATs信号转导通路，其中STAT1是STATs家族中的一员，对信号转导起主导作用^{[15, 16, 17]}。STAT1目的基因被证实具有促进炎症发生和抵抗细胞增殖作用，同时在脓毒症大鼠肺损伤模型中发现抑制STAT1活化可以减轻脓毒症所致肺组织损伤^{[18, 19]}，这和本课题研究结果相一致。

本研究中，ANP组给予西维来司钠干预能5明显降低肺组织中TNF-α,MPO,NE,MDA的表达，而且治疗后动脉血氧分压(PaO₂)升高，胰腺和肺组织病理损伤明显减轻，各组大鼠STAT1蛋白表达差异无统计学意义，ONO治疗组p-STAT1表达量显著低于ANP组。上述结果再次表明西维来司钠对SAP合并肺损伤具有保护作用，其机制可能是通过抑制STAT1蛋白的磷酸化进而下调炎症因子如TNF-α、MDA和细胞间黏附分子等促炎递质的表达，从而改善ANP大鼠的肺损伤。

本研究的不足之处是,没有阐述西维来司钠对肺损伤的保护作用和药物的剂量相关性，另外肺损伤的减轻是胰腺炎减轻后的间接效果还是西维来司钠直接对肺损伤具有保护作用需要以后进一步研究。