脓毒症(sepsis)系病原微生物入侵机体感染后所致的全身性炎症反应，是严重创伤、损伤、外科大手术后常 见的并发症^[1]。巨噬细胞作为固有免疫系统的重要组成细胞，广泛分布于全身各个组织，在病原 微生物识别、吞噬及清除中发挥主要职能，从而起到免疫监视及防御的作用。病原体可诱发巨噬细胞分泌 多种生物活性物质，如NO、TNF-α、ROS等，其中NO和ROS具有多种生物学功能，是重要的免疫调 节因子^[2]。

S1P受体(sphingosine 1-phosphate receptor，S1PRs)是一类G蛋白偶联受体，与磷酸分子1-磷酸 硝胺醇(sphingosine 1-phosphate，S1P)结合，启动细胞跨膜信号转导效应，介导S1P发挥其第一信使 作用，调节细胞增殖，血管生成和炎症反应^[3]。S1PR3作为S1PRs家族中一个主要成员，它与3 种G蛋白发生偶联(Gi、Gq、G12/G13)，介导了广泛的生物学效应。当前，对S1PR3调控中枢及外周固 有免疫细胞促炎作用的研究较为广泛^{[4, 5]}。但是，S1PR3在细菌清除中的作用如何，目前尚未 有研究报道。本研究通过合成特异性S1PR3激动剂KRX-725，探讨S1PR3参与细菌清除的功能及其分子 机制。

8周龄，体质量20~25 g，健康清洁级雄性C57BL/6小鼠40只(购自上海斯莱克实验动 物有限公司)。

大肠杆菌菌株25922(美国ATCC公司)，KRX-725由上海吉尔生化有限公司合成，并 经反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化，纯度大于99%。9个氨基酸序列同源于S1PR3胞内第二个环(143 M -R-P-Y-D-A-N-K-r₁51)。该9个氨基酸短肽的修饰方法为：Myristoyl-glycine加于该肽的N端 ，C端酸化修饰，溶解于DMSO中。 Thioglycollate Medium、 DMEM培养液(美国Gibco公司)，DMSO、庆 大霉素(美国Sigma公司),ROS探针(美国Invitrogen公司)。

随机数字法将小鼠分为两组，对照组和KRX-725治疗组，每 组20只。大肠杆菌3×10⁶溶于200 μL生理盐水中，腹腔注射诱导脓毒症模型。

建模后立即给予KRX-725或其对照溶剂，其中KRX-725治疗组 小鼠腹腔注射KRX-725(10 mg/kg)，对照组给予等体积的溶剂。KRX-725治疗组及对照组经处理后， 每8 h观察小鼠死亡情况，直至处理后第48小时(每组n=12)。

KRX-725治疗组及对照组分别于脓毒症模型后24 h(每组 n=5)，腹腔注射4 ％水合氯醛400 mg/kg麻醉：采用眼球摘除法收集小鼠外周血；对小鼠进行腹腔灌 洗和支气管肺泡灌洗。将所得血液或腹腔灌洗液按比例进行梯度稀释，LB平板37 ℃细菌培养箱过夜培养后 ，计数菌落，计算出每毫升血液或腹腔灌洗液细菌集落数(colony forming units,CFU)。

KRX-725治疗组和对照组小鼠分别在脓毒症模型后24 h(每组n=3)，腹腔 注射4％水合氯醛400 mg/kg麻醉：处死，开胸取肺脏组织。左肺上叶置于4 %多聚甲醛固定，制作石蜡切片 后及苏木精-伊红(HE)染色。HE染色后的组织切片，光镜下观察形态学改变，并进行肺损伤评分。 1分 ，为正常；2分，为肺间质炎性细胞浸润＜50%；3分，为肺间质炎性细胞浸润＞50%；4分，为肺实变及免 疫细胞浸润＜50%；5分，为肺实变及免疫细胞浸润＞50%，每组所得分数进行统计分析。

Fluid Thioglycollate Medium 诱导小鼠腹腔巨噬细胞， 所得的腹腔巨噬细胞以E.coli:细胞=10:1的比例刺激细胞，时间分别为0，10 ，20，30，40，50和60 min，刺激结束后，采用CM-H2DCFDA探针孵育检测胞内ROS水平，酶标仪测定 (激发光波长492~495 nm，发射光波长517~527 nm)。

根据按上述方法所得的腹腔巨噬细胞，加入E.coli(E.coli:细胞 =10:1)，37 ℃恒温箱，5% CO₂环境，吞噬60 min后，终止吞噬，更换新鲜DMEM培养液， 并加入庆大霉素(终浓度1 μg/mL)孵育30 min，杀灭胞外残留E.coli后，再次更换新鲜DMEM培养液 ，此时作为0点(即反应巨噬细胞吞噬能力)，继续培养于37 ℃恒温箱，5% CO₂环境，培养时间分别为 3 h、6 h(反应细胞杀菌能力)。不同时间点采用Triton X-100/PBS裂解细胞，收集裂解液，10倍梯度稀释 后，LB板培养，并计算菌落数。

使用SPSS 17.0软件进行统计学分析，生存率分析采用Log-rank test，计量 资料采用均数±标准差(x±s)表示，组间数据比较采用独立样本t检验分析，以P＜0. 05为差异有统计学意义。

如图 1所示，建模及治疗后8、16 、24、32、40、48 h，KRX-725治疗组脓毒症小鼠(n=12) 生 存率显著高于对照组(n=12)，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

KRX-725治疗组与对照组生存率比较，aP＜0.05 图 1 对照组和KRX-725治疗组脓毒症小鼠生存率的差别 Fig 1 The difference of survival rate between KRX-725 treated septic mice and control group

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为反映脓毒症小鼠细菌感染严重程度，在KRX-725干预后24 h，采集对照组(n=5)和KRX-725 治疗组(n=5)脓毒症小鼠外周血及腹腔灌洗液，检测细菌负荷。如图 2所示，KRX-725治疗组每毫 升血液中的CFU值显著低于对照组(t=3.17,P＜0.05)，两组的腹腔灌洗液CFU值差异有 统计学意义(t=3.17,P＜0.01)。

血液中KRX-725治疗组与对照组CFU的比较，aP＜0.05;腹腔中KRX-725治疗组与对照组 CFU的比较，b P＜0.01 图 2 对照组和KRX-725治疗组脓毒症小鼠24 h腹腔及血液细菌负荷的检测值的差异 Fig 2 Detection value of bacterial load in peritoneal cavity and the blood between KRX-725 treated septic mice and control after 24 hours

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为明确KRX-725对脓毒症小鼠脏器形态功能的影响，在KRX-725治疗后24 h取肺脏左叶观察(n =3)，肺脏损伤严重程度进行组织学评分。结果发现，对照组有典型的急性肺损伤的组织学改变，包括肺 泡充血、大量炎性细胞渗出浸润、弥漫性肺泡损伤等；KRX-725治疗后肺损伤的组织学变化明显减轻(图 3)。肺损伤评分：KRX-725组 1.4±0.25；对照组 2.4±0.25)，差异具有统计学意义(t=2.89, P＜0.05)。

图 3 S1PR3激动剂对脓毒症小鼠急性肺组织形态学改变的影响 (HE×40) Fig 3 The effect of S1PR3 specific agonist on the pathological changes of acute lung tissue in the septic mice (HE×40)

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为明确S1PR3上调机体杀菌功能的机制，采用E.coli体外刺激巨噬细胞，检测细胞内ROS的水平 。在第20分钟时KRX-725治疗组活性氧(ROS)的水平明显高于对照组，差异具有统计学意义(t=3 .27,P＜0.05)；在第30分钟时差异有统计学意义(t=4.61,P＜0.01)，见图 4。

KRX-725治疗组与对照组ROS含量水平的比较，20 min时及30 min时KRX-725治疗组胞内ROS水平 显著高于对照组，aP＜0.05， bP＜0.01 图 4 KRX-725对巨噬细胞早期ROS产生的影响 Fig 4 The effects of KRX-725 on the early ROS production of macrophage

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为观察升高的胞内ROS是否在巨噬细胞细菌清除中发挥作用，采用庆大霉素保护实验观察E. coli 被吞噬后的清除率。结果发现，经庆大霉素处理3 h后，KRX-725治疗组细胞内的细菌存活数明显低于对 照组(t=2.91,P＜0.05)，6 h两组之间的差异有统计学意义(t=3.88,P＜0.01)， 见图 5。

3hKRX-725治疗组与对照组菌落数的比较，a P＜0.05 ； 6hKRX-725治疗组与对照组菌 落数的比较，b P＜0.05 图 5 KRX-725对巨噬细胞细菌清除功能的影响 Fig 5 The effects of KRX-725 on the bacterial clearance of macrophage

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革兰阴性菌是脓毒症的主要致病菌^[7]。革兰阴性菌感染引起促炎症介质的大量释放，并由此 导致多器官功能不全(MODS)，其中肺脏是脓毒症的首位受累靶器官之一^{[8, 9]}。

S1PR3属于七次跨膜G蛋白偶联受体家族成员，组成性表达于巨噬细胞等固有免疫细胞表面。 Niessen等^[10]研究发现脓毒症患者外周淋巴管中树突状细胞S1PR3在介导了机体炎症反应的增强 和肺组织IL-1β水平增加中发挥重要作用。在无菌性腹膜炎中，S1PR3可介导巨噬细胞向炎症病灶的募集 和TNF-α及MCP-1的产生释放^[11]。本研究为观察S1PR3在革兰阴性大肠杆菌(Escherichia coli,E. coli)诱导脓毒症模型中的作用，腹腔注射定量E. coli建立脓毒症小鼠模型^[12]， 建模后8、16、24、32、40、48 h观察观察小鼠的生存状态，发现48 h时，对照组70%以上小鼠死亡，表明 脓毒症模型建立成功。当给予S1PR3特异性激动剂KRX-725后，小鼠48 h的生存率约提高40%，显著高于 对照组，差异具有统计学意义。KRX-725干预组建模后24 h血液及腹腔细菌负荷较对照组显著降低，急性 肺损伤程度较对照组减轻，提示KRX-725可增强脓毒症早期机体对细菌的防御能力。

活性氧(reactive oxygen species,ROS)作为第二信使参与多种细胞信号转导，影响细胞生理功能 ^{[13, 14]}。在生理状态下，适量的ROS有维持体内还原状态的作用能够提高内源性抗氧化酶如 SOD 、CAT 活性，清除过多氧化产物，使机体恢复正常稳态^{[15, 16]}。脓毒症状态下，病原体可诱发 巨噬细胞分泌ROS，已研究表明，ROS是巨噬细胞参与细菌清除的关键分子，胞内适宜浓度的ROS可干扰 胞内细菌DNA转录和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)合成，杀灭病菌或破坏细胞膜、干扰酶的功 能，从而清除微生物^{[17, 18]}。许多课题组曾尝试通早期纯氧治疗，上调脓毒症患者体内ROS的 的含量，从而达到降低促炎因子水平，改善肺损伤及提高机体对细菌的清除和防御能力的目的 ^{[19, 20, 21]}。本研究的体外实验中发现，S1PR3特异性激动剂干预巨噬细胞，可以迅速上调胞内ROS的 水平，KRX-725组细胞内ROS水平在药物作用后的20 min已明显高于对照组，30 min时到达高峰。而30 min后，KRX-725组ROS的水平缓慢下降，避免了因ROS过度累积而导致的氧化应激损伤。该结果表明 S1PR3特异性激动剂可以促进巨噬细胞早期ROS的迅速产生。采用E. coli体外刺激巨噬细胞，并观察 E. coli被吞噬后3 h及6 h的细菌清除情况，结果发现，KRX-725治疗组组E. coli感染后3 h及6 h 胞内细菌数量较对照组显著下降，提示胞内升高的ROS可能是KRX-725加速细菌清除的分子机制。

综合本研究体内、体外实验发现，S1PR3特异性激动剂KRX-725可显著改善脓毒症小鼠生存率，降低 脓毒症小鼠24 h腹腔及血液细菌负荷，减轻肺脏损伤。 机制上，KRX-725可能通过上调巨噬细胞中ROS 的水平，从而增强巨噬细胞清除细菌的能力，该研究结果不仅为S1PR3在脓毒症的早期防治机制的作用提 供新的见解，也为脓毒症和其他感染性疾病提供新的潜在的治疗靶点。