中华急诊医学杂志  2015, Vol. 24 Issue (12): 1449-1454
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林珮仪, 莫均荣, 茅海锋, 江慧琳, 陈晓辉. 急性ST段抬高型心肌梗死甲基化谱的研究[J]. 中华急诊医学杂志, 2015, 24(12): 1449-1454
Lin Peiyi, Mo Junrong, Mao Haifeng, Jiang Huilin, Chen Xiaohui. Study of DNA methylated Gene in acute ST segment elevation myocardial infarction.[J]. Chin J Emerg Med, 2015, 24(12): 1449-1454
急性ST段抬高型心肌梗死甲基化谱的研究
林珮仪, 莫均荣, 茅海锋, 江慧琳, 陈晓辉     
510260 广州，广州医科大学附属第二医院急诊科
收稿日期: 2015-06-01
基金项目： 广东省自然科学基金自由申请项目(S2013010011770)；广州市医药卫生科技一般引导项目(20141A010077)；广州市医学重点学科建设项目(2013-2015)
通信作者：陈晓辉，Email：cxhgz168@126.com
摘要：目的 应用甲基化芯片对急性ST段抬高型心肌梗死甲基化谱的研究，初步探讨急性ST段抬高型心肌梗死中甲基化谱的调控网络。 方法 选择2009年12月至2011年6月间本院在急诊科首诊并确诊为STEMI的男性患者10人，及同期本院健康体检年龄匹配的男性10人作为对照组，采用甲基化DNA免疫沉淀，分别与两张NimbleGen CpG 启动子芯片进行杂交，对杂交信号标准化和比对分析。利用SigMap和DAVID生物信息学工具对筛选基因进行染色体定位、功能分类和通路分析。 结果 STEMI组与对照组对比的DMRs的数量为1 634个，其中分布于HCP的量为1 480个(90.57%)、ICP的量为131个(8.02%)和LCP的量为23个(1.41%)；GO分析和Pathway分析显示STEMI组发生甲基化变化有显著性差异基因分布的信号通路有甘油磷酯代谢、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢、扩张型心肌病、致心律失常右室心肌病、肌动蛋白细胞骨架调节、钙离子信号通路等，而与脂质代谢相关的信号通路其甲基化变化无显著差异。 结论 运用甲基化芯片和生物信息学工具可快速、高通量地分析甲基化芯片数据，并实现对STEMI甲基化基因初步功能分类。
关键词： ST段抬高心肌梗死     甲基化芯片     GO分析     Pathway分析    
Study of DNA methylated Gene in acute ST segment elevation myocardial infarction.
Lin Peiyi, Mo Junrong, Mao Haifeng, Jiang Huilin, Chen Xiaohui     
Department of Emergency Medicine, The second affiliated hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510260, China.
Corresponding author: Chen Xiaohui, Email: cxhgz168@126.com
Abstract:Objective To investigate the regulatory networks of DNA methylation profiles in STEMI by methylation microarrays. Methods Atotal often male patients with STEMI and ten male healthy controls were recruited. Methyl-DNA immunoprecipitation and Nimblegen HG18 Meth 385K promoter plus CpG island microarrays were used to identify differentially methylated regions. And several bioinformatics analysis tools which included chromosomal assignment, gene ontology analysis and pathway analysis with SignalMap and The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery were used to high-throughput analysis. Results Compared with healthy controls, DMRs of STEMI is 1 634, There are 1 480(90.57%), 131(8.02%) and 23(1.41%)methylated sites were separately located on High CpG-containing promoter, Intermediate CpG-containing promoter and Low CpG-containing promoter; Gene Ontology and Pathway analysis expressed DNA methylated genes of signaling pathway in MI identified glycerophospholipid metabolism, cysteine and methionine metabolism, Dilated cardiomyopathy, Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy, regulation of actin cytoskeleton, calcium signaling pathway. However, the signal pathway about lipid metabolism is shown no significant difference. Conclusions Bioinformatics tools could provide the quick and high-throughput analysis of data from methylation microarray and enable the function classification of differentially expressed genes of STEMI.
Key words: ST segment elevation myocardial infarction     Methylation microarray     Gene Ontology analyze     Pathway analyze    

急性ST段抬高型心肌梗死(ST segment elevation myocardial infarction,STEMI)是急诊科常见的急危重症，属冠心病中最危重的临床类型[1][2]。STEMI是环境和遗传多因素作用的疾病，而DNA甲基化是生物体转录调控基因表达的方式之一。随着DNA甲基化研究的不断深入及芯片技术的飞速发展，基于单个候选基因小规模的研究模式显然不能完整地解释其中表观遗传的调控网络和作用机制。故本研究采用甲基化免疫沉淀(MeDIP)结合NimbleGen CpG promoter芯片技术(HG18 Meth 385K CpG plus Promoter)将STEMI患者与健康对照组差异甲基化区域(differentially methylated DNA regions,DMRs)筛选出来，然后利用生物信息学对筛选基因进行分析，初步探讨STEMI的甲基化谱调控网络。

1 资料与方法 1.1 一般资料

选择2009年12月至2011年6月间在本院急诊科首诊并确诊为STEMI的男性患者的其中10人。STEMI入选标准符合2009年ACC/AHA更新心肌梗死治疗指南[3]，包括持续胸痛20 min以上；常规12导联心电图至少相邻两导联ST段抬高，胸导联抬高≥0.2 mv、肢导联抬高≥0.1 mv；血清CK-MB水平升高超过正常水平上限2倍以上或cTnT>100 ng/L。这些患者均排除严重的肝肾疾病及恶性肿瘤，且后经冠状动脉造影检查至少两支病变以上，狭窄程度大于50%以上。选择同期本院健康体检年龄匹配的男性10人作为对照组。

1.2 材料与方法 1.2.1 基因组DNA的提取和片段化

采用Dneasy Blood & Tissue试剂盒(购自德国Qiagen公司)提取基因组DNA；用Nanodrop ND-1000检测纯化后DNA的浓度和纯度；使用超声破碎仪把每个样本基因组DNA打断为200~1 000 bp的片段。

1.2.2 免疫沉淀甲基化DNA

片段化后的DNA 1 μg，94℃热变性10 min后，快速冰浴冷却；加入1 μL能与甲基化DNA发生特异反应的鼠单克隆抗体和含0.5%BSA的PBS溶液于4℃摇床上孵育过夜。

1.2.3 回收DNA

免疫沉淀(Immunorpeci pitation,IP)甲基化DNA纯化回收使用Qiagen MinElute柱子加入200 μL的抗鼠-IgG包被的磁珠于4℃中孵育2 h，使DNA-鼠甲基化单克隆抗体复合物沉淀，用冰冷的免疫沉淀缓冲液清洗5次，用含有0.25% SDS和0.25 mg/mL蛋白激酶K的TE缓冲液65℃水浴2 h，然后冷却降至室温，重悬片段化DNA。

1.2.4 DNA扩增标记

取上述IP后的DNA和上述片段化后的DNA(Input)分别采用WGA试剂盒(购自美国Sigma公司)扩增，使用QIAquick PCR扩增试剂盒(购自德国Qiagen公司)纯化扩增后产物。

取上述扩增的产物，于98℃分别予荧光标记的Cy3-9mer 引物孵育IP的甲基化DNA(IP 样本)和Cy5-9mer 引物孵育片段化的DNA(Input 样本)10 min；然后分别加入100 pmol dNTP和100UKlenow酶(购自美国NEB公司)混匀于37℃孵育2 h。加入0.5 mol/L EDTA中止反应，标记产物用异丙醇/乙醇浓缩并定量。

1.2.5 杂交与冲洗

将经Cy3/5标记好的样品混合与罗氏 NimbleGen提供的NimbleGen杂交缓冲液/杂交组分A混匀，STEMI组与健康对照组分别与两张NimbleGen CpG启动子芯片杂交，采用罗氏NimbleGen的杂交系统杂交仪，42℃杂交16～20 h。杂交结束后，用NimbleGen冲洗缓冲液冲洗，甩干后即进行扫描。

1.3 统计学方法

采用高解析度芯片扫描仪检测杂交信号，将图像信号转变为数字信号，并经过MA-Plot，Correlation Matrix数据质控和标准化。经过校正得到每个探针的log2(IP/input)以及P值，log2(IP/input)值代表每个探针在MeDIP DNA和input DNA中的相对富集强度，P值表示探针红绿信号差异是由非生物因素造成的概率；NimbleScan对于甲基化分析采用非参数单边KS检验，通过KS检验得到片段发生甲基化的富集度P<0.01则判断为发生甲基化，PeakScore为-lg(P-value)即PeakScore>2表示该探针代表一个甲基化事件。

2 结果 2.1 研究对象的一般资料

10例男性STEMI病例年龄为(66.3±9.6)岁；对照组的年龄为(64.8±7.8)岁，两组间平均年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 染色体定位

染色体定位分析，在急性心肌梗死患者中各染色体甲基化数目(除Y染色体外)普遍较健康对照组高，在1号染色体发生的甲基化基因最多为208个，Y染色体最少为35个，见图 1。

图 1 染色体甲基化频数分布 Fig 1 Frequency distribution of Chromosome methylation
图选项
2.3 芯片数据结果分析

按照PeakScore>2为筛选标准，STEMI组发生甲基化位点2 695个，这些位点包含了2 488个基因；对照组发生甲基化位点1 867个，这些位点包含了1 715个基因。导入SignalMap软件中得出Peaks即为甲基化区域，STEMI组与对照组相比，得出DMRs，STEMI组相对对照组DMRs的数量为1 634个，其中分布于高CG含量启动子的量为1 480个(90.57%)、中CG含量启动子的量为131个(8.02%)和低CG含量启动子的量为23个(1.41%)。

2.4 Gene Ontology分析

GO分析结果按P值排序从生物学过程(BP)、细胞成分(CC)以及分子功能(MF)三个方面列于下表中，分别为STEMI组发生甲基化基因GO分析的生物学过程注释、细胞成分注释和分子功能注释，分别见表 1、表 2、表 3；以及STEMI组发生去甲基化基因GO分析的生物学过程注释见表 4。

表 1 STEMI组甲基化基因GO生物学过程注释 Table 1 Annotation of methylation gene of STEMI in Biological process
GO TermCountP-ValueBenjamini
GO:0007409~axonogenesis375.18E-070.001 737
GO:0030030~cell projection organization575.81E -070.001 059
GO:0048812~neuron projection morphogenesis382.18E -060.003 976
GO:0010629~negative regulation of gene expression693.25E -060.005 922
GO:0048667~cell morphogenesis involved in neuron differentiation373.65E -060.006 650
GO:0031175~neuron projection development425.26E -060.009 616
GO:0000904~cell morphogenesis involved in differentiation409.34E -060.017 025
GO:0048858~cell projection morphogenesis401.03E -050.018 785
aGO:0008610~lipid biosynthetic process400.003 2590.164 319
aGO:0010889~regulation of sequestering of triglyceride40.012 5330.344 939
aGO:0045017~glycerolipid biosynthetic process130.018 6760.43 428
aGO:0010876~lipid localization200.032 3330.544 977

注：a标记的分别为参与脂质生物合成、甘油三酯代谢调节、甘油脂类生物合成和脂质锚定的生物学过程

表选项
表 2 STEMI组甲基化基因GO细胞成分注释 Table 2 Annotation of methylation gene of STEMI in Cellular component
GO TermCountP-ValueBenjamini
GO:0005794~Golgi apparatus1012.69E-050.014 267
GO:0045202~synapse440.001 9950.413 895
GO:0032432~actin filament bundle80.002 7950.392 965
GO:0031982~vesicle720.003 4270.368 173
GO:0001725~stress fiber70.008 2350.587 194
GO:0044431~Golgi apparatus part350.011 1460.486 381
GO:0032838~cell projection cytoplasm40.012 5440.458 801
GO:0030173~integral to Golgi membrane90.015 4130.405 123
aGO:0005911~cell-cell junction240.019 9850.417 265
GO:0031228~intrinsic to Golgi membrane90.022 6520.442 181
GO:0031985~Golgi cisterna60.023 3180.436 606
GO:0016363~nuclear matrix100.026 0210.458 436
GO:0000139~Golgi membrane220.048 6820.544 016

注：a标记的分别为参与细胞缝隙连接

表选项
表 3 STEMI组甲基化基因GO分子功能注释 Table 3 Annotation of methylation gene of STEMI in Molecular function
GO TermCountP-ValueBenjamini
GO:0032555~purine ribonucleotide binding1936.22E-060.007 008
GO:0032553~ribonucleotide binding1936.22E-060.007 008
GO:0017076~purine nucleotide binding1999.90E-060.005 577
GO:0004672~protein kinase activity781.18E-050.004 425
GO:0000166~nucleotide binding2271.19E-050.003 346
GO:0019904~protein domain specific binding484.27E-050.009 608
GO:0005524~ATP binding1564.83E-050.009 047
GO:0004712~protein serine/threonine/tyrosine kinase activity86.35E-050.010 199
GO:0032559~adenyl ribonucleotide binding1576.77E-050.009 521
GO:0030695~GTPase regulator activity480.003 6870.206 955
aGO:0019992~diacylglycerol binding130.00 5890.251 927
aGO:0008092~cytoskeletal protein binding540.015 5560.415 428
aGO:0051015~actin filament binding100.020 3340.448 572

注：a标记的分别为甘油二脂结合分子、细胞骨架蛋白结合分子和肌动蛋白细肌丝等与STEMI发生发展密切的细胞分子功能

表选项
表 4 STEMI组去甲基化基因GO生物学过程注释 Table 4 Annotation of de methylation gene of STEMI in Biological process
GO TermCountP-ValueBenjamini
GO:0051276~chromosome organization391.81E-050.043 205
GO:0006325~chromatin organization324.65E-050.055 147
GO:0007049~cell cycle511.59E-040.121 061
GO:0065003~macromolecular complex assembly438.09E-040.389 371
GO:0044271~nitrogen compound biosynthetic process250.001 4460.506 429
GO:0022402~cell cycle process370.001 6250.483 717
GO:0016568~chromatin modification220.001 7870.46 381
GO:0022403~cell cycle phase290.002 2180.491 821
GO:0016053~organic acid biosynthetic process150.002 3070.465 276
GO:0046394~carboxylic acid biosynthetic process150.002 3070.465 276
aGO:0031532~actin cytoskeleton reorganization50.002 5850.468 133
GO:0043933~macromolecular complex subunit organization430.002 8140.464 643
GO:0051327~M phase of meiotic cell cycle110.003 9720.554 658
GO:0007126~meiosis110.003 9720.554 658
GO:0007212~dopamine receptor signaling pathway50.004 0930.536 741
aGO:0050848~regulation of calcium-mediated signaling40.038 2510.817 075

注：a标记的分别为肌动蛋白细胞骨架重组和参与钙离子的信号通路与STEMI发生发展密切的生物学过程

表选项
2.5 Pathway分析

STEMI组与对照组相比，发生甲基化的基因有1 529个，在KEGG映射中，分析出423个通路，其中结果显示的信号通路有扩张性心肌病、甘油磷酯代谢、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢、致心律失常右室心肌病、钙离子信号通路和肥厚型心肌病等信号途径为差异具有统计学意义，P<0.05，见表 5。

表 5 STEMI组甲基化基因Pathway分析 Table 5 Pathway analyses of methylation gene of STEMI
Pathway CountP-ValueBenjamini
hsa05223:Non-small cell lung cancer130.001 252 4680.188 843
hsa04520:Adherens junction160.001 378 7960.10 882
hsa00532:Chondroitin sulfate biosynthesis80.001 464 4490.078 342
hsa04666:Fc gamma R-mediated phagocytosis180.001 812 3620.072 938
hsa04012:ErbB signaling pathway170.001 824 9210.059 184
hsa04912:GnRH signaling pathway180.002 562 0660.068 913
hsa04916:Melanogenesis180.002 863 2680.06 612
hsa04810:Regulation of actin cytoskeleton310.002 950 1980.059 813
ahsa05414:Dilated cardiomyopathy160.008 099 8130.086 567
ahsa00564:Glycerophospholipid metabolism130.009 204 5970.092 006
ahsa00270:Cysteine and methionine metabolism80.019 412 7840.158 279
ahsa05412:Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy (ARVC)130.021 491 7670.158 672
ahsa04020:Calcium signaling pathway230.032 916 5830.200 352
ahsa05410:Hypertrophic cardiomyopathy (HCM)130.046 567 0130.255 429

注：a标记的分别为扩张性心肌病、甘油磷酯代谢、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢、致心律失常右室心肌病、钙离子信号通路和肥厚型心肌病

表选项

STEMI组与对照组相比，去甲基化的基因有757个，在KEGG映射中，分析出174个通路。结果显示的信号通路有钙离子信号通路、促性腺激素释放激素、神经营养蛋白、长时程增强效应、缝隙连接等，P< 0.05。见表 6。

表 6 STEMI组去甲基化基因Pathway分析 Table 6 Pathway analyses of de methylation gene of STEMI
Pathway CountP-ValueBenjamini
hsa04020:Calcium signaling pathway140.006 560 4880.609 856
hsa04912:GnRH signaling pathway90.017 778 9830.722 694
hsa04722:Neurotrophin signaling pathway100.024 645 6880.695 626
hsa04720:Long-term potentiation70.027 255 2390.627 642
hsa04540:Gap junction80.031 000 5020.593 694
表选项
3 讨论

DNA甲基化是生物体调控基因表达的方式之一，基因调控元件(如启动子)所含CpG岛中的5’甲基胞嘧啶(5mC)会阻碍转录因子复合物与DNA的结合，所以DNA甲基化一般与基因沉默有关，而非甲基化一般与基因的活化有关[4]。随着对甲基化的研究的不断深入及芯片技术的飞速发展，出现各种甲基化检测方法。其中，甲基化DNA免疫沉淀MeDIP-chip是目前高通量分析基因组DNA甲基化变化的一种准确可靠的实验方法[5, 6]。2010年英国剑桥大学Movassagh等[7]首次应用MeDIP-chip证明心衰患者左心组织存在异常的DNA甲基化(AMOLT2、ARHGAP24、PECAM1)，从而影响心室重构引起心功能不全。

笔者采用MeDIP结合NimbleGen CpG promoter芯片技术(HG18 Meth 385K CpG plus Promoter)对STEMI与对照组差异甲基化区域进行分析发现，从染色体定位分析可见，STEMI组中各染色体上(除Y染色体)甲基化基因数目普遍比健康对照组多，其中1，17号染色体上发生的甲基化基因最多，Y染色体上甲基化基因最少。根据芯片结果分析，STEMI组与健康对照组相比DMRs量为1 634个，而且90.57%分布在HCP区域中，根据本实验结果推测STEMI的发生发展可能与1号或17号染色体上基因HCP区域的DMRs有关。

GO分析和Pathway分析显示，STEMI组发生甲基化的基因分布的信号通路有肌动蛋白细胞骨架调节、钙离子信号通路、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢、甘油磷酯代谢、扩张型心肌病、致心律失常右室心肌病等信号通路。同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)和半胱氨酸是甲硫氨酸的中间代谢产物，高Hcy症是动脉粥样硬化的危险因素。目前认为高Hcy血症致动脉粥样硬化主要的病理生理机制与血管平滑肌细胞增生、血小板激活、凝血及纤溶系统失衡有关[8, 9, 10]。而冠状动脉粥样硬化是STEMI发病的病理生理学基础[11, 12]。我们推测在半胱氨酸和甲硫氨酸代谢通路中发生甲基化的基因可能与STEMI的发病有关。虽然在脂质代谢的生物学过程中有若干基因参与脂质的生物合成如甘油三酯代谢调节、甘油脂类生物合成、脂质锚定，但在Pathway分析中无发现统计学差异的脂质代谢通路。

DNA的去甲基化治疗在多种遗传和环境因素影响的疾病中已屡见报道，Moseley等[13]发现使用绿茶提取物茶多酚(epigallocatechin 3-gallate,EGCG)可以抑制甲基化敏感的结肠癌细胞中的DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs)从而抑制肿瘤细胞的生长。本研究发现在STEMI组中甲基化基因的通路分析显示，与心功能相关的心肌病变的信号通路有扩张型心肌病、致心律失常右室心肌病和钙离子信号通路。这些通路可能是STEMI发病后心功能迅速恶化的机制之一，针对这些通路上的靶向基因的去甲基治疗可能会减缓心功能的恶化，为STEMI的治疗提供新的药物靶点。

在GO和Pathway分析中，DMRs除了分布于参与脂质代谢、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢以及心肌病变等信号通路外，还参与于肌动蛋白细胞骨架、张力纤维、缝隙连接、黏附连接等信号通路中，但目前这些方面在STEMI的研究甚少，它们在STEMI发病中作用值得进一步探讨。

笔者从NimbleGen HG18 Meth 385K CpG plus Promoter芯片筛选出STEMI与对照组的DMRs，并利用GO分析和Pathway分析筛选了部分候选基因待进一步研究，至于这些基因调控表达的情况是否与芯片提示一致，并且在蛋白水平上是否发生改变，有待后期的研究中进一步验证。

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