中华急诊医学杂志  2015, Vol. 24 Issue (12): 1412-1416
苏拉明对脂多糖致小鼠急性肺损伤的防治作用
郑君刚, 侯金超, 张凯, 黄长顺, 方向明     
310003 杭州,浙江大学医学院附属第一医院城站院区麻醉科[郑君刚(在职研究生、现宁波市第一医院麻醉科工作)、侯金超、张凯、方向明];
宁波市第一医院麻醉科(郑君刚、黄长顺)
摘要目的 探讨苏拉明(suramin)对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱发小鼠急性肺损伤的防治作用及其分子机制。 方法 24只健康清洁级雄性C57BL/6小鼠以随机数字法分为生理盐水对照组和苏拉明治疗组,分别于生理盐水和苏拉明处理后静脉注射LPS(5 mg/kg)建立肺损伤模型,并于造模后0 h、24 h及72 h,取肺组织进行苏木精-伊红染色(HE染色)评估生理盐水对照组和苏拉明治疗组的肺脏病理损伤程度;采用RT-PCR检测肺组织中肿瘤坏死因子(TNF-α)和白介素-6(IL-6)mRNA的表达水平。体外分别用生理盐水和苏拉明处理人单核细胞白血病细胞(THP-1细胞株)后,给予100 ng/mL LPS刺激,建立体外脓毒症模型,应用Western Blot法检测LPS刺激后10 min、20 min、30 min细胞内丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)信号转导通路关键分子ERK1/2、JNK及P38蛋白的磷酸化水平。组间数据比较采用独立样本t检验分析,P<0.05为差异具有统计学意义。 结果 与生理盐水对照组相比,苏拉明可明显减轻LPS对小鼠(72 h)肺组织的损伤程度(生理盐水组,3.90±0.35;苏拉明组,2.50±0.12)(t=7.668,P<0.01),且显著性降低LPS处理24 h后肺组织TNF-α的表达水平(生理盐水组,8.35±1.63;苏拉明组,4.62±0.70)(t=4.187,P<0.01)和IL-6 mRNA的表达水平(生理盐水组,10.53±2.10;苏拉明组,5.53±1.10)(t=4.224,P<0.01);苏拉明可显著下调LPS刺激THP-1细胞后10 min、20 min及30 min 胞内MAPK信号通路ERK1/2、JNK、P38蛋白的磷酸化水平。 结论 苏拉明对LPS诱发的肺损伤具有保护作用,其下调促炎因子表达的机制可能与抑制单核细胞MAPK通路的活化有关。
关键词脓毒症     肺损伤     脂多糖     苏拉明    炎性反应    中文    炎症因子    单核细胞    MAPK    
Preventive and therapeutic effects of suramin on lipopolysaccharide-induced mouse model of acute lung injury and its molecular mechanism
Zheng Jungang, Hou Jinchao, Zhang Kai, Huang Changshun, Fang Xiangming     
Department of Anesthesiology, First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou 310003, China
Corresponding author: Fang Xiangming, Email: xiangming_fang@163.com
Abstract:Objective The purpose of this research is to study the preventive and therapeutic effects of suramin on lipopolysaccharide (LPS) -induced mouse model of acute lung injury and its molecular mechanism. Methods A total of 24 healthy male C57BL/6 mice were randomly divided into two groups:Control group and suramin group. LPS(5 mg/kg, iv)induced acute lung injury model was used in this study. The severity of lung injury was evaluated using haematoxylin-eosin (HE) staining after the injection of LPS for 0, 24 and 72 hours. The expression of TNF-α and IL-6 mRNA levels were also detected by RT-PCR. In vitro, THP-1 cells were stimulated by LPS (100 ng/mL) with saline or suramin pre-treatment. The expressions of p-ERK1/2, p-JNK and p-P38 were analyzed by Western blot at 10 min, 20 min and 30 min after LPS insult. A 2-tailed Student’ s t test was used to compare difference between two independent groups. Results Compared with the saline group, the lung tissues injury were significantly decreased in the suramin group of 72 hours after the injection of LPS(saline 3.90±0.35; suramin 2.50±0.12)(t=7.668,P<0.01). The expressions of TNF-α(saline 8.35±1.63; suramin 4.62±0.70)(t=4.187,P<0.01) and IL-6(saline 10.53±2.10; suramin 5.53±1.10)(t=4.224,P<0.01)mRNA were also obviously reduced in suramin group after the injection of LPS for 24 hours. The expression levels of p-ERK1/2, p-JNK and p-P38 were obviously down-regulated by suramin at 10 min, 20 min and 30 min after LPS stimulation. Conclusions Suramin protected LPS-induced acute lung injury through down-regulating the expression of pro-inflammatory factors, which was closely relative to the inhibition of the MAPK pathway.
Key words: Sepsis     Acute lung injury     Lipopolysaccharide     Suramin     Inflammatory response     Cytokine     Monocyte     MAPK    

肺脏是严重创伤、大手术、脓毒症后最早发生功能不全且发生率最高的器官[1, 2]。目前由于缺乏针对性强的有效防治方法,脓毒症合并肺损伤患者的病死率高达43%~72%,因此寻找治疗急性肺损伤( acute lung injury,ALI)的有效措施是当前脓毒症治疗的关键问题之一[3, 4]。近年来越来越多的研究证实苏拉明在调控免疫细胞炎症反应和抑制细胞凋亡中发挥重要作用[5, 6, 7]。苏拉明是否对脂多糖诱导的急性肺损伤具有防治作用,目前尚无报道。本研究旨在探讨苏拉明对脂多糖诱发的小鼠急性肺损伤的防治作用,以期为临床上综合治疗脓毒症提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 实验动物及材料 1.1.1 实验动物

24只健康清洁级雄性C57BL/6小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司),6周龄,体质量20~25 g,自由饮水和摄食,12 h光照,12 h黑暗,保持室温20~25 ℃,空气湿度维持在50%~55%,以蛋白含量为21%的标准饲料饲养。随机数字法将小鼠分为两组:生理盐水对照组和苏拉明治疗组,每组12只。

1.1.2 实验细胞

人单核细胞白血病细胞株(THP-1细胞,ATCC细胞库,美国)。细胞培养基为含10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养液(Gibco公司,美国)。细胞培养于5% CO2,37 ℃恒温培养箱。体外100 ng/mL LPS刺激建立脓毒症模型,并分为对照组(生理盐水处理组)和苏拉明处理组。

1.2 实验方法 1.2.1 模型制作及实验分组

苏拉明治疗组给予小鼠苏拉明(Tocris公司,英国),以10 mg/kg的剂量尾静脉注射,生理盐水对照组给予等体积的生理盐水,30 min后建立脂多糖诱导小鼠肺损伤模型。肺损伤模型建立:LPS(大肠杆菌055:B5,Sigma公司,美国)以5 mg/kg的剂量(溶于0.15 mL生理盐水中)尾静脉注射。THP-1细胞给予LPS 100 ng/mL浓度刺激制备脓毒症细胞模型。

1.2.2 肺组织处理

苏拉明治疗组和生理盐水对照组小鼠分别在肺损伤模型后0 h、24 h、72 h时间点各取4只,腹腔注射4%水合氯醛400 mg/kg麻醉,摘眼球放血处死后,开胸取肺脏组织。①左肺上叶置于4%多聚甲醛,固定、包埋、切片后行HE染色,进行病理切片的制作[8]。光镜下观察形态学改变,并进行肺损伤评分。肺损伤评分方法[9]:两名研究者采用盲法进行评分,在相同的光圈和放大倍数条件下(×10倍),每张切片随机取5个视野,计算出平均分,然后进行肺脏损伤评分统计。1分,为正常;2分,为肺间质炎性细胞浸润<50%;3分,为肺间质炎性细胞浸润>50%;4分,为肺实变及免疫细胞浸润<50%;5分,为肺实变及免疫细胞浸润>50%,每组所得分数进行统计分析。②取右肺上叶组织置于液氮中待提取组织RNA。

1.2.3 RNA提取及RT-PCR方法检测肺组织炎症因子的表达

取右肺上叶组织Trizol法提总RNA,按逆转录试剂盒(Takara公司,日本)说明将总RNA逆转录为cDNA,根据GenBank中小鼠的基因序列,使用Primer 5.0软件设计β-actin、TNF-α和IL-6引物,β-actin (sense):5’-CTACAATGAGCTGCGTGTG-3’,β-actin(antisense):5’-GCGTGAGGGAGAGCATAG-3’;TNF-α(sense):5’-TACTGAACTT CGGGGTGA-3’ ,TNF-α(antisense):5’-ACTTGGTGGTTTGCTACG-3’;IL-6(sense):5’-GCCTTCTTGGGACTGATG-3’,IL-6(antisense):5’-AGGTCTGTTGGGAGTGGTA-3’。采用ABI7500 Real-Time检测仪(ABI公司,美国)检测,并用仪器自带软件进行分析,以2-△△ct 值反映TNF-α和IL-6 mRNA的相对表达水平。

1.2.4 Western Blot法检测MAPK通路上关键蛋白的活化

取培养的THP-1细胞,显微镜下调整细胞数量为1×106 mL-1,加到6孔板中,每孔各加培养液2 mL。苏拉明处理组为使每孔苏拉明终浓度为0.4 mg/mL,对照组(生理盐水处理组)每孔加入等体积生理盐水,将培养板放入37 ℃、5%CO2培养箱孵育30 min后,取出培养板,显微镜下观察细胞形态。在对照组和苏拉明处理组中加入LPS,每孔LPS终浓度为100 ng/mL,分别在加入LPS后10 min、20 min、30 min后,取出培养板,无菌吸取细胞培养液,1 200 r/min离心10 min后弃上清,RIPA裂解液+苯甲基磺酰氟(PMSF)裂解细胞,提总蛋白,用Western Blot法检测丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路关键分子ERK1/2、P-ERK1/2、JNK、P-JNK、P38、P-P38蛋白的表达情况。

1.3 统计学方法

使用SPSS 17.0软件做统计学分析,计量资料采用均数±标准差(x±s)表示,组间数据比较采用独立样本t检验分析,以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 肺组织病理变化

生理盐水对照组小鼠在造模24 h和72 h时,肺泡扩张不均匀,肺泡壁普遍增厚,毛细血管扩张淤血,肺间质部及肺泡腔内有较多的炎性细胞浸润,72 h时部分脓毒症小鼠肺泡壁结构不清,肺泡腔内还可见大量红细胞。苏拉明治疗组脓毒症小鼠肺组织病理损伤程度较生理盐水对照组在模型后72 h明显降低,肺泡扩张较均匀,局部肺泡壁增厚,间质局部见少量炎细胞浸润,肺泡腔清晰,未见明显肺泡淤血和肺水肿。具体肺组织病理学评分。见表 1

表 1 肺组织病理学评分Table 1 The pathological gradings of the pulmonary tissue
(x±sn=4)
组别0 h24 h72 h
生理盐水对照组12.50±0.263.90±0.35
苏拉明治疗组12.25±0.102.50±0.12 a
t11.8067.668
P0.3560.1210.001
注:苏拉明治疗组与生理盐水对照组(72 h)比较,a P<0.01
2.2 肺组织TNF-α mRNA表达的变化

生理盐水对照组和苏拉明治疗组小鼠,24 h、72 h时间点肺组织TNF-α mRNA的表达水平较0 h均明显上调;苏拉明治疗组小鼠24 h时的肺组织TNF-α mRNA表达水平较生理盐水对照组小鼠显著性降低(P<0.01)。见表 2

表 2 肺组织TNF-α表达变化Table 2 The expression of TNF-α in the pulmonary tissue
(x±sn=4)
组别0 h24 h72 h
生理盐水对照组1.02±0.158.35±1.632.05±0.19
苏拉明治疗组1.21±0.234.62±0.70 a2.30±0.16
t-1.3844.187-1.987
P0.2160.0060.094
注: 苏拉明治疗组与生理盐水对照组(24 h)比较,a P<0.01
2.3 肺组织IL-6 mRNA表达的变化

生理盐水对照组和苏拉明治疗组小鼠,24 h、72 h时间点肺组织IL-6 mRNA的表达水平较0 h均明显上调,苏拉明治疗组小鼠24 h、72hIL-6 mRNA表达水平较生理盐水对照组24 h、72 h均显著性降低(a P<0.01,b P<0.05)。见表 3

表 3 肺组织IL-6表达变化Table 3 The expression of IL-6 in the pulmonary tissue
(x±sn=4)
组别0 h24 h72 h
生理盐水对照组1.17±0.2810.53±2.1012.7±2.13
苏拉明治疗组1.10±0.215.53±1.10 a9.20±1.17 b
t0.4164.2242.837
P0.6920.0060.03
注:苏拉明治疗组与生理盐水对照组(24 h)比较,a P<0.01;与生理盐水对照组(72 h)比较,b P<0.05
2.4 苏拉明调控单核细胞MAPK信号通路活性

与对照组(生理盐水处理组)比较,苏拉明处理组THP-1细胞MAPK信号通路ERK1/2、JNK、P38蛋白磷酸化水平在LPS刺激后10 min、20 min及30 min均明显下调。见图 1

人单核细胞THP-1细胞系苏拉明 0.4 mg/mL 预处理30 min后,LPS 100 ng/mL刺激10 min、20 min、30 min,通过Western Blot检测MAPK信号通路中关键蛋白P-ERK1/2、P-JNK、P-P38蛋白的表达情况 图 1 人单核细胞P-P38、P-ERK1/2、P-JNK的表达变化 Fig 1 Changes in the expression levels of P-P38, P-ERK1/2 and P-JNK in THP-1 cells
3 讨论

脓毒症中,血液中细菌成分如内毒素(lipopolysaccharide,LPS)等病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)作用于外周血单核细胞表面Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs),启动单核细胞经典活化程序,可激活MAPK、NF-kB等通路[10],释放大量炎症因子,同时分泌单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1),IL-8等趋化因子,促进单核细胞募集到肺组织,诱发肺组织过度的炎症反应,引起血气屏障完整性受损、毛细血管通透性增加、肺间质充血水肿、肺泡萎陷,最终导致气体交换障碍,引起ALI,进而造成急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),因此,单核细胞的激活是引起ALI的始动因素之一[11, 12, 13, 14]。在动物急性肺损伤模型中,内毒素是最常用的诱导剂[15]。本实验中,通过小鼠静脉注射LPS成功建立ALI模型,从病理形态学上观察小鼠在造模后随着时间的延长,病变程度逐渐加重,造模72 h时出现广泛的炎性细胞浸润、肺水肿及局部肺出血等肺实变现象,呈现典型的ALI改变现象。

TNF-α为肺损伤早期重要的促炎细胞因子,主要由活化的单核巨噬细胞产生和释放,在ALI中起始动作用,可启动后续ALI的一系列病理改变[16]。IL-6是由TNF-α、IL-1β诱导下由单核细胞及血管内皮细胞产生又一重要的细胞因子,可进一步使炎症放大和持续,与炎症反应的程度相关,常被作为评价脏器损伤严重程度的主要指标[17]。随着炎性细胞和炎症介质互成反馈,炎性反应不断扩大,最终形成瀑布样级联反应,促进中性粒细胞的活化并释放大量弹性蛋白酶及氧自由基,造成肺毛细血管内皮细胞及上皮细胞受损,肺毛细血管屏障破坏,肺通透性增高,肺血管与间质之间液体交换障碍,导致ALI或ARDS[18, 19]。因此,抑制过度炎症反应有望成为治疗脓毒症相关ALI的靶点。Abraham等[20]及Fisher等[21]分别使用TNF-α单克隆抗体和IL-1受体拮抗剂治疗脓毒症,但最终均以失败告终,可见细胞因子种类及其数量繁多,且交互作用形成了一个级联的网络系统,靶向针对单一炎性介质的治疗不足以改善脓毒症患者的预后。

苏拉明(suramin,分子式C51H34N6O23S6Na6,相对分子质量1429.21)是一种多磺酸萘醌盐类合成的聚阴离子化合物,是德国BAYER AG公司于1961年合成的一种抗锥虫类化合物,主要用于治疗非洲锥虫病和盘尾丝虫病。近年来发现苏拉明通过抑制细胞凋亡介导了肝肾的保护作用,同时其在下调爆发性肝衰竭小鼠的血浆促炎因子水平和核因子NF-κB的活性中也发挥关键作用[5, 6, 7]。在本研究中,使用苏拉明处理可明显减轻脓毒症小鼠肺组织病理学损伤,减少外周血炎性细胞在肺组织的积聚,同时肺组织炎性因子TNF-α和IL-6的表达在肺损伤早期明显下调,表明苏拉明可早期抑制外周血单核细胞活化,减少其向肺组织募集,从而控制脓毒症致肺损伤的发生发展。

单核细胞是人体最主要固有免疫细胞之一,进入组织后成为巨噬细胞,单核/巨噬细胞是炎性细胞因子的主要来源细胞[22]。单核细胞表面CD14脂多糖受体在介导病原体吞噬、抗原提呈及炎症介质释放等方面有着至关重要的作用[23, 24]。单核细胞的炎症反应状态参与是脓毒症早期病理生理改变[25]。在本研究中,采用人单核细胞白血病细胞(THP-1细胞)来探讨苏拉明作用的分子机制,与生理盐水组比较,苏拉明处理组THP-1细胞MAPK信号通路上ERK1/2、JNK、P38蛋白磷酸化水平分别在LPS分别刺激10 min、20 min、30 min时均明显下调,因此笔者推测苏拉明减轻脓毒症肺损伤的分子机制可能与抑制单核细胞MAPK信号通路的活化有关。

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