失血性休克后，常规静脉复苏虽可恢复并维持血压、心率等中心血流动力学参数，但肝脏等重要内脏微循环血管呈持续进行性收缩及低灌注，因而常出现早期肝损伤并进而导致多器官功能障碍(MODS)甚至死亡^[1]。辅助腹腔复苏(adjunct peritoneal resuscitation，APR)可逆转休克及静脉复苏后的内脏微血管收缩、改善微循环血供，防止MODS发生并降低病死率，被认为是“数十年来可望改善休克复苏效果的重大突破”^[2]，但其对失血性休克早期肝损伤的动态影响及机制尚未明确。笔者通过复制失血休克大鼠模型，观察两种不同液体行APR对失血性休克早期不同时点大鼠病死率、肝功能、肝病理改变、肝湿/干质量(W/D)比值及肝组织NF-κB和热休克蛋白70(HSP70)mRNA表达的干预作用，从而探讨APR对失血性休克早期肝损伤的治疗作用及可能机制。

NF-κB引物：5'-TGGATGGACAGGCGTTGA-3'(上游)，5'-AGACAGGACCTCTGAGAAAGT-3'(下游)；

HSP70引物：5’-CGCTGGAGCCCGTGGAGAAG-3’ (上游)，5’-GCGGCCCTTGTCGTTGGTGAT-3’ (下游)；

β-actin引物：5'-ACTCCTACGTGGGCGACGAG-3’(上游)，5'-AGGTCCAGACGCAGGATGGC-3'(下游)；

均由日本Takara公司合成。2.5%葡萄糖腹膜透析液(广州百特医疗用品有限公司)组成：每100 mL中含：葡萄糖2.5 g，氯化钠538 mg、448 mg乳酸钠、25.7 mg氯化钙、5.08 mg氯化镁，pH值为5.2，渗透压为396 mOsm/L；紫外可见光分光光度计(美国Bio-RAD)；RT-PCR试剂盒(Takara公司)；PCR 扩增仪(美国Gene Cycler公司)；Gel Doc 2000型凝胶电泳成像分析系统(美国Bio-RAD公司)

健康雄性成年Wistar大鼠96只，体质量200～220 g，由中山大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(粤)2011-0029。随机数字表法分为对照组、失血性休克+常规静脉复苏组(休克组)、失血性休克+常规静脉复苏+林格液腹腔复苏组(APR1组)、失血性休克+常规静脉复苏+腹膜透析液腹腔复苏组(APR2组只)共四组。各组动物又分失血性休克复苏后1 h、2 h和6 h共3个时点，每个时点各8只大鼠。

采用改良Wiggers法制备失血性休克动物模型，腹腔注射戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉并固定动物。肛温维持在(37±0.5) ℃。眨眼反射及疼痛回缩反射消失后，行单侧颈动脉及右股动脉、静脉插管(置管前行肝素化)。股动脉插管以备放血或采血检查各项指标，股静脉插管以备液体复苏输液用。颈动脉插管后连接到LMS-2B型二道生理记录仪监测血压，稳定10 min。以1 mL/min的速度从股动脉放血到含肝素的注射器内，直到血压为平均动脉压(MAP)的40%并维持60 min。当血压低于40%MAP时，通过股静脉持续少量泵入生理盐水维持。复苏前死亡的大鼠不计入本组实验，另取大鼠补充。

对照组：仅进行手术操作，不放血诱导休克及复苏。 休克组：维持40%MAP 60 min后，在30 min内将失血+2倍失血量的生理盐水通过输液泵经股静脉泵入，为常规液体复苏。林格液APR组(APR1组)：在休克组基础上，于开始股静脉复苏的同时，一次性向腹腔内注入100 mL/kg林格液。腹膜透析液APR组(APR2组)：在休克组基础上，于开始股静脉复苏的同时，一次性向腹腔内注入100 mL/kg 2.5%葡萄糖腹膜透析液。

计算各组大鼠休克复苏后6 h内累计病死率。

于复苏结束后上述各个时点分别活杀大鼠，取股动脉血，用全自动生化分析仪检测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转按酶(AST)及总胆红素(TB)。

剩余肝组织精确称湿质量，置80℃烘箱内烘48 h至恒重，计算W/D比值。

取右肝叶1 cm³标本2块，常规固定、石蜡包埋、切片行HE染色，光镜下观察，肝组织损伤程度按肝小叶破坏数量百分比计算，分为无(0％)，轻度(1%～25％)，中度(26%～50％)和重度(>50％)。

取肝组织，Trizol试剂提取肝组织总RNA，按反转录试剂盒说明书合成cDNA。PCR反应条件为：94 ℃预变性3 min；然后94 ℃变性30 s；55 ℃复性45 s；72 ℃延伸1 min，共40个循环，最后于72 ℃延伸7 min。PCR产物电泳后经溴化乙锭染色，凝胶成像分析系统进行分析，分别以NF-κB、HSP70与β-actin条带灰度比值作为各自mRNA表达量。

用统计软件SPSS16.0处理数据，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组间差异采用方差分析，计数资料组间差异用检验及Fisher精确概率检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

复苏后6 h内，对照组及APR2组无大鼠死亡；休克组分别于1.5、3、5 h各死亡1只；APR1组分别于1.5 h、5.5 h各死亡1只。四组累计病死率分别为0、0、12.50%和8.33%，差异无统计学意义(χ²＝4.464，P＞0.05)。

复苏后1 h，休克组血清ALT及AST水平即出现升高，在6 h内呈随时间延长而递增趋势。与休克组及APR1组同时点比较，APR2组各时点血清ALT及AST水平均明显降低(均P＜0.05)；APR2组6 h血清ALT及AST水平比对照组升高(均P＜0.05)。各组各时点的血清总胆红素(TB)差异无统计学意义(P＞0.05)。见表 1，2。

大鼠失血性休克后肝W/D比值随时间延长而升高。休克组及APR1组2 h、6 h与对照组比较，差异具有统计学意义。APR2组6 h时点与对照组差异具有统计学意义；2 h、6 h时点与休克组及APR1组差异均有统计学意义(均P＜0.05)。见表 3。

休克组复苏后1 h，肝窦轻度扩张、淤血，内有少数中性粒细胞浸润；肝小叶结构正常，个别肝细胞变性。休克组复苏后2 h，肝窦扩张、淤血，内有中性粒细胞浸润；部分肝小叶结构紊乱，部分肝细胞变性、坏死。复苏后6 h，休克组大鼠肝脏汇管区有炎性细胞浸润，肝细胞坏死呈小片状，部分小叶结构破坏。APR1组各时点病理改变与休克组比较无明显改善。APR2组复苏后6 h内病理改变比休克组及APR1组明显减轻(均P＜0.05)。见表 4。

休克组复苏后1 h肝组织NF-κB、HSP70 mRNA表达即较对照组显著增加，复苏后6 h内呈随时间延长递增趋势，各时点与对照组差异均具统计学意义(均P＜0.05)。与休克组及APR1组比较，APR2组2 h、6 h肝组织HSP70 mRNA表达增强、NF-κB mRNA表达降低(均P＜0.05)，见图 1、图 2及表 5、表 6。

1～5分别代表marker、对照组、休克组、ARP1及APR2组 图 1 RT-PCR检测各组大鼠不同时点NF-κB的mRNA表达 Fig 1 Expressions of NF-κB mRNA in each group at different time points determined with RT-PCR

图选项

1～5分别代表marker、对照组、休克组、ARP1及APR2组 图 2 RT-PCR检测各组大鼠不同时点HSP70的mRNA表达 Fig 2 Expressions of HSP70 mRNA in each group at different time points determined with RT-PCR

图选项

失血性休克及常规静脉复苏后，肝脏等重要内脏微循环血管呈持续进行性收缩及低灌注状态。应激、缺血缺氧、再灌注损伤导致巨噬细胞、多形核白细胞等效应细胞被激活，失控性释放炎症介质，产生全身炎症反应综合征(SIRS)，损伤内皮细胞及远隔器官，引起严重的组织细胞损伤，最终常导致MODS^[3]。

NF-κB是多种信号转导途径的汇聚点，在调节炎症反应基因中起关键作用、在SIRS及MODS发病中担当重要角色。已证实NF-κB可高效诱导多种细胞因子、黏附分子、趋化因子和急性期反应蛋白的基因表达，同时也参与调控炎性级联瀑布效应多种酶的基因表达 ^{[4, 5, 6]}。因此，许多学者提出，NF-κB是极具潜力的新型抗炎靶点。

HSP70通过保护正常蛋白结构、修复或清除损伤蛋白，起到保持细胞内环境稳态而不受环境或物理损伤的作用。其具有修复离子通道、恢复氧化-还原平衡、抑制炎症细胞因子及阻止细胞凋亡途径激活等多种保护功能。HSP70升高可减少创伤性休克动物及患者病死率，改善创、烧伤患者肝、肠、肺等重要脏器的继发功能损害^{[7, 8]}。

本研究结果表明，大鼠失血性休克后6 h内，血清ALT、AST水平及W/D比值随时间延长而升高，提示失血性休克早期存在肝损伤并随时间延长而加重。此外，失血性休克后早期肝组织NF-κB、HSP70 mRNA表达均出现了增强，提示两者均参与了失血性休克后肝损伤过程。

在常规静脉复苏基础上，APR可快速逆转失血性休克及常规静脉复苏后内脏低灌注并增加生存率。其可能作用机理包括^[9－13]：减轻组织细胞水肿和液体扣押，促进早期液体循环；保护肠黏膜屏障，减轻肠道和全身炎症反应；减轻组织脂质过氧化反应和缺血-再灌注损伤；恢复肠黏膜血管内皮细胞功能，增加重要器官血流；改善能量代谢。尽管复苏液体与腹腔内脏器直接接触可部分解释腹内脏器血流的增加，但腹腔复苏后腹外器官如肺和骨骼肌血流的增加就不能用复苏液体与脏器直接接触来解释。

Dokladny等^[14]的研究表明，HSP70可通过阻止NF-κB抑制物IκBα的降解及NF-κB P65核易位，从而影响NF-κB的表达和活化。本实验结果表明，2.5%葡萄糖腹膜透析液腹腔复苏能改善肝功能、肝病理损伤以及肝W/D比值，且能增强肝组织HSP70 mRNA表达并降低NF-κB mRNA表达。提示腹膜透析液改善失血性休克早期肝损伤及减轻肝组织水肿的作用机制可能是通过增强肝组织HSP70 mRNA表达、抑制NF-κB mRNA表达来实现的。而等体积林格液腹腔注射则无血管扩张及治疗作用，主要是因为2.5%葡萄糖腹膜透析液中含有重要血管活性成分^[15]：高渗是其产生血管活性的主要原因；腹透液引起的血管扩张效应中，高渗及活跃细胞内葡萄糖摄取共同占了75%的作用，而葡萄糖降解产物约起25%的作用；乳酸盐仅在低pH值时具血管活性。

综上所述，2.5%葡萄糖腹膜透析液APR可减轻肝组织病理损伤和组织水肿，有效防治失血性休克早期肝损伤，其作用机制可能与增强肝组织HSP70 mRNA表达、抑制NF-κB mRNA表达有关。