2015, Vol. 24
急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是具有高发病率和高病死率的临床常见危急重症 [1, 2]。目前研究也表明AKI能增加患慢性肾脏疾病(chronic kidney disease，CKD)的风险，是CKD发生的主要危险因素[3, 4]。虽然历经几十年的研究，但因其发病机制复杂、缺乏针对性的治疗靶点，因此，AKI患者的预后一直没有得到明显改善。
缺血-再灌注损伤(ischemic reperfusion injury,IRI)是引起AKI的主要原因[5]。在缺血-再灌注过程中可导致多种炎症细胞的聚集及炎症因子的释放，导致肾脏炎性损害。缺血预处理 (ischemic preconditioning，IPC) 是短时间缺血预处理对随后长时间、持续性缺血性损害具有保护作用的现象[6]，但机制至今仍不清楚。
本研究通过夹闭双侧肾蒂15 min造成预缺血，4 d后再夹闭双侧肾蒂使肾脏遭受缺血-再灌注损伤，构建预缺血-再灌注肾损伤小鼠模型，观察IPC对肾脏TNF-α的表达影响及意义。
1 材料与方法 1.1 材料雄性6~8周龄C57BL/6J小鼠(湖南斯莱达实验动物有限公司，中国)；TNF-α抗体(Santa Cruze公司，美国)；免疫组化试剂盒、DAB显色试剂(北京中杉金桥生物技术有限公司，中国)；M-MLV、Oligo(dT)15 Primer、Taq[宝生物工程(大连)有限公司，中国]；引物(上海生物工程技术有限公司，中国)；全自动生化分析仪(西门子ADVIA 2400，德国)；梯度PCR仪(ABI Veriti 96，美国)；凝胶成像分析仪(FluorChem FC3，美国)。
1.2 方法 1.2.1 动物分组采用随机数表法将108只雄性6~8周C57BL/6J小鼠(22~25 g)分为3组：缺血-再灌注组(IR组)、假预缺血-再灌注(S+IR组)组和预缺血后再灌注组(IPC+IR组)。各组又根据再灌注时间点分别分为9个亚组，即再灌注后0、3、6、12、24、48、72 h、5 d、7 d。
1.2.2 模型建立缺血-再灌注肾损伤模型(IR组)：3 mL/kg 10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，腹部正中切口，游离双侧肾蒂，用无损伤动脉夹持续夹闭双侧肾蒂30 min，然后松开动脉夹，恢复灌注；缺血预处理再灌注模型(IPC+IR组)：第0天用3 mL/kg 10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，腹部正中切口，游离双侧肾蒂，无损伤动脉夹持续夹闭双侧肾蒂15 min，造成预缺血，间隔4 d后，再次腹腔注射3 mL/kg 10%水合氯醛麻醉小鼠，腹部正中切口，无损伤动脉夹持续夹闭双侧肾蒂30 min，造成缺血，然后松开动脉夹，恢复灌注；假缺血预处理再灌注模型(S+IR组)：第0天采用3 mL/kg 10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，腹部正中切口，仅游离双侧肾蒂，不夹闭，其余同IPC+IR组。
1.2.3 血清肌酐、尿素氮检测经腹主动脉取血。血标本3 000 r/min 5 min离心处理，留取血清-70 ℃保存。全自动生化分析仪检测小鼠血清肌酐(serum creatinine,Scr)和尿素氮(urea nitrogen,BUN)浓度。
1.2.4 HE染色观察肾脏病理损害情况2 μm石蜡切片常规烤片、脱蜡、梯度乙醇脱水,苏木精染色,盐酸酒精分化,饱和碳酸锂返蓝,伊红染色,脱水透明后用中性树胶封片。
1.2.5 肾小管间质病理损害计量评分采用盲法，由两名有经验的肾脏病理医师完成，每张切片在200倍光镜下随机选取皮髓质交接部10个不重叠视野观察肾脏病理损害并评分，正常为0分，受损肾小管间质面积﹤25%为1分，25%~50%为2分，50%~75%为3分，>75%为4分，以此做半定量分析并计算其均数，评分值越高代表损伤程度越重[7]。
1.2.6 反转录PCR检测TNF-α mRNA表达水平用Trizol 提取肾组织RNA，再反转录成cDNA，然后进行PCR 扩增。TNF-α上游引物5’- TCTACTCCCAGGTTCTCTTC -3’，下游引5’- GCAGAGAGGAGGTTGACTTT -3’。内参照选用GAPDH,上游引物5’-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3’,下游引物5’- CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3’。反应条件为：95 ℃变性30 s，95 ℃10 s，55 ℃30 s，70 ℃1 min，共30个循环。1.5%琼脂糖凝胶，100 V电泳45 min，凝胶成像系统获取并保存图像，DRAFT-alphaview软件分析图像中的条带灰度，记录结果。以TNF-α mRNA拷贝数与内参照GAPDH mRNA拷贝数的比值作为TNF-α的相对表达量。
1.2.7 免疫组织化学染色方法检测肾组织TNF-α蛋白质表达及结果判断4 μm肾组织石蜡切片，常规烤片、脱蜡、梯度乙醇脱水，3%H2O2封闭后柠檬酸盐缓冲液中高温抗原修复，兔抗小鼠TNF-α抗体4 ℃过夜→聚合物辅助剂孵育→辣根酶标记山羊抗兔多聚IgG孵育→DAB显色→苏木精复染→1%盐酸酒精分化→饱和碳酸锂返蓝→透明、封片→光镜下观察结果。阴性对照予PBS替代一抗，步骤同上。用莱卡显微镜图像系统采集图像，Image-pro plus 6.0软件分析其吸光度值(A)。
1.8 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计学处理，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，多组间差异比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q法，以P < 0.05为差异具有统计学意义。 2 结果 2.1 各组小鼠血清肌酐、尿素氮水平IR组再灌注后Scr水平逐渐增高，再灌注24 h达到峰值，之后逐渐降低；IPC+IR组再灌注后，Scr水平虽然也缓慢上升，但在各时间点均明显低于IR组；S+IR组在再灌注各个时间点与IR组水平基本一致。IR组、IPC+IR组0h~7 d各时间点的Scr水平均差异有统计学意义(P <0.01)(图 1A)。
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| A：各组小鼠Scr水平比较(μmol/L)；B：各组小鼠BUN水平比较(mmol/L)；与IR组同时间亚组比较，aP <0.01 图 1 各组小鼠肾功能比较 |
IR组再灌注后BUN水平逐渐增高，再灌注24 h达峰值，之后逐渐降低；IPC+IR组再灌注后BUN水平虽然也呈现上升趋势，但其在各时间点均显著低于IR组；S+IR组在再灌注各个时间点与IR组水平大致相同。IR组、IPC+IR组在3 h~7 d每个同时间点亚组的BUN水平均差异有统计学意义(P <0.01)(图 1B)。
2.2 各组小鼠肾脏病理及肾小管间质病理损伤评分R组小鼠肾脏病理损害随再灌注时间的推移逐渐加重，24 h达到高峰，此时可见大范围的肾小管上皮细胞肿胀、空泡变性，部分肾小管上皮细胞刷状缘扁平、管腔扩张，部分肾小管上皮细胞可见片状坏死、脱落，肾小管基底膜裸露；部分扩张的肾小管管腔内可见大量的上皮细胞碎片、红细胞管型，肾间质内可见灶性炎性细胞浸润，再灌注5 d、7 d，小鼠肾组织改变明显减轻，扩张的肾小管逐渐恢复正常，炎症细胞浸润减少之后逐渐下降；S+IR组肾脏病理损伤与IR组基本相同；IPC+IR组再灌注后肾脏病理损伤的变化趋势与IR组一致，但损伤程度较IR组明显减轻(图 2A)。
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| A：部分小鼠肾脏病理HE染色(×200)；B：各组小鼠肾小管间质病理损伤评分比较 (分) ；与IR组同时间亚组比较，aP <0.05 图 2 小鼠肾脏病理损伤比较 |
IR组、IPC+IR组在各个同时间点肾小管间质病理损害评分均差异有统计学意义(P <0.05)(图 2B)。
2.3 各组小鼠肾脏TNF-α表达变化IR组再灌注后TNF-α mRNA表达逐渐上升，再灌注24 h达峰值，随后逐渐下降；S+IR组与IR组TNF-α mRNA的基本一致；IPC+IR组在各个时间点亚组的TNF-α mRNA表达水平一直较IR组明显降低。IR组与IPC+IR组比较，在再灌注3 h~5 d各个同时间点亚组的TNF-α mRNA表达差异均具有统计学意义(P <0.05)(图 3)。
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| A：RT-PCR方法检测TNF-α mRNA表达；B：TNF-α mRNA相对表达柱状图。与IR组同时间亚组比较，aP <0.05 图 3各组小鼠肾脏TNF-α mRNA相对表达水平比较 |
IR组再灌注后TNF-α蛋白质表达逐渐上升，48 h达最高，48 h~72 h保持高值，之后逐渐减低；IPC+IR组小鼠肾脏TNF-α蛋白质的变化趋势与IR组一致，但在各个时间的表达水平一直较IR组明显减低。IR组与IPC+IR组在再灌注3 h~7 d各个时间点亚组TNF-α蛋白质表达差异有统计学意义(P <0.01)(图 4)。
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| A：部分小鼠肾脏组织免疫组织化学染色，×200；B：各组小鼠肾脏TNF-α蛋白质表达水平比较。与IR组同时间亚组比较，P <0.05。a：IR-0 h组；b：IR-48 h组；c：IR-7 d组；d：S+IR-0 h组；e：S+IR-48 h组；f：S+IR-7 d组；g：IPC+IR-0 h组；h：IPC+IR-48 h组；i：IPC+IR-7 d组 图 4 小鼠肾脏TNF-α蛋白质表达水平 |
缺血-再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury，IRI)是引起AKI的主要原因。肾脏IRI发病机制非常复杂，至今尚未阐述清楚。既往研究多关注ATP减少、氧自由基与氧化应激、细胞内钙超载和细胞凋亡等方面[8]。但之后的研究发现肾脏IRI不仅是中断血供后组织缺血缺氧的结果，而且在再灌注过程中可激发炎症反应，导致炎症细胞聚集和肾固有细胞的增殖，是由固有免疫和适应性免疫共同参与的炎症性疾病，有学者把肾脏IRI等同于“炎症性疾病”[9, 10, 11, 12]。
TNF-α是一个重要的促炎症细胞因子，可直接或间接通过产生白介素-l、白介素-2、白介素-6、白介素-8等因子引起炎症。TNF-α与内皮细胞结合可增加过氧化物阴离子产生，刺激细胞脱颗粒和产生髓质过氧化物酶，从而促使内皮细胞分泌白介素-8、白介素-1等炎症因子，并促进中性粒细胞在内皮细胞上黏附，进而刺激机体局部发生炎症反应，导致炎症进一步发展扩大[13]。也有研究显示，TNF-α通过激活诱导型一氧化氮合酶(iNOs)，使一氧化氮合成加重，进而刺激外周血单核细胞释放白介素-8，使炎症反应进一步加重[14]。缺血-再灌注损伤可导致TNF-α表达增加，进而引起组织、器官结构和功能的损害[15]。
IPC对组织、器官随后的IRI具有保护作用，但具体作用机制仍不十分明了。Murry等[16]首次证实IPC对不同器官具有保护作用始于1~3 h不等。在肾脏中，IPC对IRI 肾脏的保护作用出现很早，并且可以持续到再灌注后很多天[17, 18, 19, 20]。
本研究通过夹闭双侧肾蒂30 min，造成缺血，建立AKI小鼠模型。结果发现再灌注后小鼠Scr、BUN水平明显上升，24 h达到最高峰，然后逐渐下降。并且这种变化与肾脏病理损伤变化一致。TNF-α在再灌注后表达逐渐增高，再灌注24hTNF-α mRNA达峰值，48 h蛋白质表达达到最高值，随后逐渐降低。说明肾脏IRI后可以促进TNF-α的表达，激发炎症反应，导致炎性损伤。最后，笔者进一步在缺血-再灌注前第4天夹闭双侧肾蒂15 min，造成肾脏预缺血，然后再对肾脏施行缺血-再灌注损害。结果发现肾脏经历IPC后，Scr、BUN水平明显下降，肾脏病理损伤明显减轻，TNF-α mRNA及蛋白水平明显降低，而S+IR组却未见这些变化。说明IPC可能通过下调TNF-α表达，抑制炎症反应，对AKI肾脏起保护作用。
综上所述，IPC对AKI具有保护作用，这种保护作用可能跟IPC下调TNF-α表达，抑制肾脏炎症反应有关。
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