随着医学的发展，心肺复苏的成功率逐年提高，但绝大多数恢复自主循环的患者死于复苏后综合征(post-resuscitation syndrome,PRS)，究其重要原因之一是复苏后肠道的缺血-再灌注损伤导致肠屏障受到破坏，导致肠道内细菌移位，引发肠源性脓毒症^[1]。乌司他丁是经典的抗炎药物，可以减少机体促炎介质的释放，抗氧化应激，减少心肺复苏后大鼠神经细胞的凋亡，防止缺血-再灌注损伤^[2]，但对心肺复苏后肠道受损的保护作用未见报道。本研究的目的是观察乌司他丁对心肺复苏后受损的肠屏障是否有保护作用及其可能的机制。

戊巴比妥钠(45~60 mg/kg)腹腔注射麻醉，颈部胸骨上窝以上一横指处1 cm纵向切口，钝性分离到气管，引导14号鞘管套针经口气管插管；左股动脉放置23 号PE-50聚乙烯管到达剑突下；分离双侧颈静脉，左颈静脉置23号PE-50聚乙烯管到右心房，右颈静脉放置4号电极导管；肢体和体表插入针头电极连接多导生理参数仪持续监测肢体Ⅱ导联心电图，股动脉和左侧颈静脉导管连接压力传感器与多导生理参数仪相连分别持续监测动脉压和右房压力，将多导生理参数仪模拟数据经数据采集卡采集后经模数转换引入到电脑，专用软件实时记录数据并保存。 心尖部皮下插入负极针头，右侧颈静脉电极导管插入电极钢丝(正极)到右心室内膜，体表心电图确认电极放置位置。致颤前10 min机械通气开始(潮气量0.65 mL/100 g，氧体积分数21%)，用低于10 mA交流电经触及右心室内膜指引钢丝和体表负极针头形成的交流电回路持续致颤3 min和观察5 min，总共8 min无处理室颤。然后胸外按压和同步机械通气，频率分别为200次/min和100次/min，复苏6 min后，连续给予最多3次的2 J双向波除颤。自主循环恢复标准：室上性心律、MAP≥60 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)并且维持5 min以上；自主呼吸建立后连续监测2 h血流动力学。

健康雄性SD大鼠21只，购买于中山大学动物实验中心，体质量400~450 g，随机分为3组，即假手术对照组(sham组，n=7)、心肺复苏组(CPR组，n=7)和乌司他丁组(UTI组，n=7)。Sham组大鼠麻醉后行动静脉插管，不进行致颤、心肺复苏，CPR组按心肺复苏模型制作过程操作，UTI组在致颤、心肺复苏前2 h经尾静脉注射UTI(100 000 U/kg)，其余程序同CPR组，而CPR组实验前2 h注入等量无菌生理盐水。

复苏成功的大鼠在48 h处死，心脏取血，离心后血清-80 ℃保存；切取部分回肠，一份置于10%福尔马林溶液-4 ℃保存，一份置于3%的戊二醛溶液中送电镜检测；一份回肠切除后液氮速冻，之后于-80 ℃保存。

通过ELISA试剂盒检测(试剂盒购于达科为生物技术有限公司)，严格按试剂盒说明书操作。

采用TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)细胞凋亡检测试剂盒(购于罗氏公司)进行细胞凋亡检测，按说明书操作，简单描述为：标本经石蜡包埋、切片、染色，光镜下凋亡的细胞被染成棕色。

肠黏膜caspase-3的表达采用Western blot检测，简述如下：肠黏膜放入置于冰块当中的匀浆器中捣碎成匀浆后，加入预冷的总蛋白裂解液于冰上裂解30 min，继以低温高速(20 000 g)离心30 min，取上清，用BCA法测定蛋白质浓度(PIERCE BCATM 蛋白试剂盒，Thermo Fisher Scientific Inc，美国)。蛋白于-80 ℃冰箱保存。电泳前按3∶ 1体积比与上样缓冲液混合，100 ℃变性5 min，约取20 μg蛋白上样于12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后转印至NC膜上，封闭1 h，4 ℃孵育特异性一抗(caspase-3抗体购于Cell Signaling Technology，美国)，过夜，一抗反应结束后与HRP标记的特异性二抗(US Biological，美国)室温孵育1 h，ECL试剂处理曝光。然后将NC膜洗脱后再次封闭，以兔抗鼠GAPDH抗体(Novus Biologicals，美国)处理进行印迹反应，最后扫描图片，以Adobe Photoshop7.0软件分析条带吸光度。

切取回肠标本(约1 mm³)固定于3%戊二醛的缓冲液(pH=7.4，4 ℃)中，PBS冲洗后固定于1%四氧化锇1 h。固定组织逐级乙醇脱水，树脂包埋。超薄切片机切取70 nm切片，用4% 醋酸双氧铀和0.4%柠檬酸铅固定。采用H-600透射电镜(日立生产)观察细胞间紧密连接的增宽或开放情况。

统计分析用SPSS 17.0统计软件完成，计量资料用均数±标准差 (x±s) 表示，多组间比较用单因素方差分析。组间两两比较采用LSD-t检验，以P <0.05为差异具有统计学意义。

复苏成功后48hCPR组大鼠血清中TNF-α 和 IL-1β的质量浓度明显升高，UTI组较sham组高，但低于CPR组，见表 1。

肠黏膜TUNEL染色显示，sham组可见很少量棕色颗粒，CPR组可见较多棕色颗粒，而UTI组较CPR组明显减少(图 1)。

A：sham组；B：CPR组；C：UTI组 图 1 三组大鼠肠黏膜TUNEL染色(×200) Fig 1 TUNEL staining of the intestinal mucosa of three group rats(×200)

图选项

CPR组肠黏膜caspase-3的表达较sham组、UTI组明显增高，UTI组肠黏膜caspase-3的表达较sham组高，而较CPR组明显降低(图 2)。

与sham组比较，a P <0.05；与UTI组比较，bP <0.05; n=3 图 2 三组大鼠肠黏膜caspase-3的表达 Fig 2 The expression of intestinal mucosal caspase-3 in three group

图选项

透射电镜下观察可见，sham组大鼠肠黏膜上皮细胞间紧密连接为正常形态，未见明显增宽；UTI组可见部分上皮细胞间紧密连接增宽，程度较轻；CPR组可见较多上皮细胞间紧密连接增宽、开放，程度明显(图 3)。

A：sham组；B：UTI组；C：CPR组 图 3 电镜下三组大鼠肠黏膜紧密连接情况(×18 500) Fig 3 Tight junction of intestinal mucosa under electron microscope in three groups(×18 500)

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心肺复苏是心搏骤停的必须抢救措施，随着医疗技术水平的提高，复苏成功率有所上升，但复苏后多数患者还是死于复苏后综合征^[3]。心搏骤停、心肺复苏会造成全身各个器官发生缺血-再灌注损伤，肠道也不例外。有研究提示，在复苏成功后1~3 d，心脏及全身多个器官功能逐渐改善，但肠道渗透性增加，血清中炎症介质如IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α明显增加，容易导致全身炎症反应综合征，进而出现多器官功能不全综合征，最终患者死亡^[4]。另有研究提示，经腹腔诱导亚低温治疗对心肺复苏后大鼠心肌有保护作用，与降低促炎因子释放有关^[5]。复苏后综合征的发生原因之一是与复苏后肠道遭受缺血-再灌注损伤而导致的肠屏障破坏有关^[6]。肠屏障破坏后肠道内细菌发生移位，影响心肌功能，进而引起机体血流动力学不稳，影响复苏后患者的存活率^[7]。

本研究发现，心肺复苏后肠黏膜呈持续高炎症状态，炎症因子TNF-α 和 IL-1β在CPR组明显增高，TUNEL染色阳性比例明显增高及caspase-3的高表达提示肠上皮细胞发生凋亡，而且电镜下可见CPR组肠上皮细胞间紧密连接明显增宽、开放，这一系列的病理生理变化可能与复苏后肠黏膜呈持续高炎症状态，炎症因子失控性级联放大，导致肠上皮细胞发生凋亡，肠屏障受损，肠道内细菌发生移位，出现菌血症、毒血症，甚至脓毒症、脓毒性休克，进而随着血液循环导致心肌受损，出现循环不稳。有研究表明，接受失血和内毒素刺激后的大鼠肠系膜淋巴液加入正常大鼠的心肌细胞培养基中培养，结果显示正常心肌细胞出现凋亡现象，而结扎肠系膜淋巴管可以减轻大鼠的心肌损伤^[8]。

乌司他丁是从人尿液中发现的尿胰蛋白酶抑制剂，它能抑制多种水解酶的活性，减轻水解酶对组织器官的损害，稳定溶酶体膜、清除氧自由基及脂多糖、调控炎症介质释放，抑制心肌抑制因子产生，改善休克时的循环障碍状态，抑制血栓素、血管内皮素升高，维持内源性血管活性物质的动态平衡，抑制凝血系统活化，改善重要脏器灌流^{[9, 10]}。这种保护作用与乌司他丁具有抗炎、抗氧化应激，降低NF-κB的激活，下调相关炎症介质的表达相关^[2]。本实验证明大鼠经历心肺复苏后血液中炎症因子呈高表达，肠黏膜caspase-3高表达，肠上皮细胞出现明显凋亡改变，而且，电镜下观察到肠屏障紧密连接明显增宽、开放，而乌司他丁治疗组明显降低血液中炎症介质TNF-α 和 IL-1β的水平，降低caspase-3的表达，减少肠黏膜上皮细胞的凋亡，改善肠屏障功能，差异有统计学意义，这说明乌司他丁可以改善心肺复苏后大鼠肠黏膜的高炎症状态，减少促炎因子的释放，降低凋亡蛋白酶的表达，从而减轻肠上皮细胞凋亡的发生，对心肺复苏、缺血-再灌注引起的肠屏障损伤有保护作用，为临床治疗提供实验依据。