2015, Vol. 24
宁波大学医学院急诊医学研究所
心脏骤停(cardiac arrest,CA)是发达国家人群死亡的首要原因。随着我国人口老龄化的比例增加，CA的发生亦日益增多。据统计，每年美国和加拿大因为CA死亡的人数超过30万，我国每年死于CA的患者高达54.4万[1]。临床上75%～80% CA患者的心脏节律首先显示为心室颤动，为心源性猝死的主要原因[2]。心室颤动导致的CA存在3个阶段：电生理障碍阶段(0～4 min)、循环障碍阶段(4～10 min)和代谢紊乱阶段(>10 min)[3]。在实际工作中，急救人员通常需要至少8 min赶到院外CA现场，此时患者多已进入后两个阶段[4]。然而，CA后心肺复苏(cardiopulmonary resuscitation,CPR)每延迟1 min，患者生存率将下降7%～10%[5]。近来CPR技术的进步，使CA患者的自主循环恢复率已显著提高40%～60%，但是院内病死率仍高达67%[6]。研究发现，经受长时程CA的患者在恢复自主循环后，将进入另外一个更加复杂的复苏阶段——心脏骤停后综合征，其已成为CA患者复苏后死亡的独立危险因素[7]。如何提高CPR的成功率，改善CA患者复苏后的存活时间与生存质量，成为当前亟待解决的难题。建立理想的动物模型以及新技术新方法的实验评价与临床试验，成为CPR研究中迫切且必不可少的环节。本研究应用电刺激法诱导室颤，建立10 min的长时程猪室颤CA模型，评价该模型的稳定性及其在心脏骤停后综合征研究中的应用价值。
1 材料与方法 1.1 实验动物国产健康雄性白猪14头，体质量(38±3)kg，购自上海甲干生物科技有限公司，动物合格证号：SCXK(沪)2010-0028。
1.2 实验仪器上海奥尔科特ALC-V10动物呼吸机，深圳迈瑞BeneView T6监护仪，美国ZOLL的E Series除颤监护仪与CPR stat-padz除颤电极，德国PULSION的PiCCOplus容量监测仪及附件，美国EDWARDS的Swan-Ganz导管与压力传感器，电动负压吸引器。
1.3 动物准备实验前，动物禁食12 h，不禁水。实验中，氯胺酮20 mg/kg肌肉注射诱导麻醉后，戊巴比妥钠30 mg/kg经耳缘静脉实施静脉全麻，此后戊巴比妥钠8 mg/(kg·h)维持麻醉状态。静脉全麻后，经口气管插管，连接动物呼吸机进行机械通气，参数设置为潮气量15 mL/kg、呼吸频率12次/min和FiO2 21%。通过双上肢与左下肢心电电极，进行常规的Ⅱ导联心电图连续监测。
暴露右股动脉，用于CA前、复苏后植入PiCCO动脉导管和采集动脉血标本，及CPR期间植入Swan-Ganz导管监测胸主动脉血压。暴露右股静脉，用于植入Swan-Ganz导管监测右心房压、核心温度和采集静脉血标本。暴露右颈外静脉，用于CA前、复苏后植入PiCCO静脉导管，及CA时植入诱颤电极至右心室。整个实验过程中，使用控温毯维持动物体温在(37.5±0.5) ℃。
1.4 电刺激法诱导室颤诱颤前10 min，采集动物的基础数据，如血流动力学参数、心肺功能指标、动脉血气及静脉血标本。经诱颤电极释放1 mA交流电至右心室，诱导心室颤动。诱颤成功标准为心电图呈室颤波形，动脉血压显著下降、搏动波形消失。室颤成功后，断开呼吸机，停止机械通气，无干预观察10 min，然后开始CPR，其包括人工胸外按压和球囊辅助通气，比例30∶ 2。ZOLL除颤监护仪用于实时监测胸外按压质量，保证按压深度≥5 cm、频率≥100次/min。CPR 2.5 min后，静脉注射肾上腺素20 μg/kg。CPR 5 min后，给予能量150 J的双向波电除颤1次，并判断是否自主循环恢复。自主循环恢复的 标准为室上性自主心律伴平均动脉压>50 mm Hg，持续5 min以上[8]。若自主循环未恢复，立即进行2 min的CPR，然后电除颤1次。如此重复此流程5次后，动物仍未达到自主循环恢复，视为复苏失败。肾上腺素在首次注射后，每3 min重复使用一次。复苏成功的动物，重新机械通气观察4 h后脱机拔管，并拔除全身各处有创导管，消毒与缝合切口，送回饲养房观察68 h。复苏后72 h，静脉注射戊巴比妥钠150 mg/kg予以安乐死，进行动物尸体解剖，记录重要脏器的解剖结果。
1.5 观察指标实验中持续监测动物的心率与血压。CPR期间，记录所有动物的复苏情况，如冠脉灌注压、复苏时间、复苏成功率、肾上腺素用量及除颤次数等。在CA前与复苏后1 h、2 h、3 h、4 h进行PiCCO监测，评估每搏输出量(stroke volume,SV)、全心射血分数(global ejection fraction,GEF)、血管外肺水指数(extra-vascular lung water index,ELWI)和肺血管通透性指数(pulmonary vascular permeability index,PVPI)。在CA前与复苏后2 h、4 h抽取动脉血，检测血气分析。在CA前与复苏后2 h、4 h、24 h，采集静脉血检测肌钙蛋白I (cTNI)、N-末端脑钠肽前体 (NT-proBNP)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白介素-6(interfernon-6,IL-6)的水平，以及复苏后24 h、48 h、72 h采集静脉血检测神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)和S-100B蛋白(S-100B)的水平，同时参考Berg等[9]的方法进行神经功能缺损评分(neurological deficit score,NDS)。NDS范围为0～400分，0分为没有神经功能缺损，400分为脑死亡或死亡。猪cTNI、NT-proBNP、TNF-α、IL-6、NSE及S-100B的ELISA试剂盒购自上海美轩生物科技有限公司，指标检测均按试剂说明书步骤进行。
1.6 统计学方法
使用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差(
±s)表示，同一参数在不同时间点的比较采用重复测量数据的方差分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。
CA前，实验动物的基础心率为(114±8) 次/min，动脉压为(110±8) mmHg，以及心功能参数如SV与GEF、氧和指数、血乳酸水平等指标均在生理许可范围(表 1、2)。经诱颤电极放电后，所有动物即刻出现室颤波形，室颤发生率为100%(14/14)。CPR期间，所有动物的复苏时间是(7.7±4.0) min，肾上腺素用量为(1.6±1.3) mg，除颤次数为(2.4±2.0) 次，其中一次除颤成功率50%(7/14)，2次除颤成功率28.6%(4/14)。结果11头猪恢复自主循环，3头猪死亡，复苏成功率为78.6%(11/14)。复苏成功的动物均存活72 h，72 h存活率仍为78.6%(11/14)。
±s)
Table 1 The changes of SV, GEF, ELWI and PVPI prior to CA and post resuscitation in all animals(±s) | 指标 | CA前 | PR 1 h | PR 2 h | PR 3 h | PR 4 h |
| 注：CA心脏骤停；PR复苏后；SV每搏输出量；GEF全心射血分数；ELWI血管外肺水指数；PVPI肺血管通透性指数；与CA前相比，aP＜0.01 | |||||
| SV (mL) | 39.9±3.2 | 21.5±3.3a | 22.9±3.2a | 24.2±3.3a | 24.5±2.8a |
| GEF (%) | 29.2±1.9 | 13.8±2.6a | 14.8±2.3a | 15.3±1.8a | 15.6±2.1a |
| ELWI (mL/kg) | 9.0±1.3 | 16.1±2.3a | 15.1±1.8a | 15.0±1.4a | 14.9±1.6a |
| PVPI | 1.9±0.2 | 5.7±0.9a | 4.7±1.3a | 5.1±1.1a | 5.1±1.5a |
PiCCO监测显示复苏后4 h所有动物均出现明显的心功能不全，复苏后1 h的SV、GEF下降至CA前的50%左右，随后呈现逐渐恢复趋势，但与基础心功能相比差异具有统计学意义(均P＜0.01) (表 1)。心脏血清标志物检测显示cTNI在复苏后持续升高，复苏后2 h轻度升高，复苏后4 h、24 h显著升高，与CA前相比具有统计学意义(均P＜0.01)；NT-proBNP在复苏后2 h迅速升高，复苏后4 h达到平衡，与CA前相比差异具有统计学意义(均P＜0.01) (表 2)。
2.3 CPR前后动物的肺功能变化所有动物在复苏后4 h的观察期间，ELWI、PVPI检测值均显著高于基础值，与CA前相比差异具有统计学意义(均P＜0.01)，提示机体出现急性肺水肿(表 1)。结合复苏后的氧合指数变化，显示PaO2/FiO2值明显低于CA前的基础值(P＜0.01)，且检测值＜300 mmHg，提示急性肺损伤的存在(表 3)。
±s)
Table 2 The changes of serum cTNI, NT-proBNP, TNF-α and IL-6 prior to CA and post resuscitation in all animals(±s，pg/mL) | 指标 | CA前 | PR 2 h | PR 4 h | PR 24 h |
| 注：CA心脏骤停；PR复苏后；cTNI肌钙蛋白I；NT-proBNP N-末端脑钠肽前体；TNF-α肿瘤坏死因子-α；IL-6白介素-6；与CA前相比，aP＜0.01 | ||||
| cTNI | 138±18 | 156±22 | 346±49a | 504±48a |
| NT-proBNP | 71±25 | 241±86a | 315±82a | 317±60a |
| TNF-α | 114±25 | 292±39a | 357±48a | 426±37a |
| IL-6 | 100±27 | 237±31a | 269±35a | 292±38a |
±s)
Table 3 The changes of PaO2/FiO2 and arterial blood lactate prior to CA and post resuscitation in all animals(±s) | 指标 | CA前 | PR 2 h | PR 4 h |
| 注：CA：心脏骤停；PR：复苏后；PaO2/FiO2：氧和指数；LAC：乳酸；与CA前相比，aP＜0.01 | |||
| PaO2/FiO2 (mmHg) | 434±66 | 290±56a | 285±69a |
| LAC (mmol/L) | 1.2±0.4 | 5.0±2.8a | 2.9±1.5a |
CA前所有动物没有神经功能缺损，复苏后的72 h观察期间，NDS评分显示所有动物均存在严重的神经功能缺损，随着观察时间延长，神经功能逐渐恢复，但与CA前相比差异具有统计学意义(均P＜0.01)。同时，脑损伤标志物检测显示复苏后的血清NSE、S-100B水平显著升高，复苏后48 h达到高峰，明显高于CA前的水平，比较差异均具有统计学意义(均P＜0.01) (表 4)。
±s)
Table 4 The changes of NDS, serum NSE and S-100B prior to CA and post resuscitation in all animals(±s) | 指标 | CA前 | PR 24 h | PR 48 h | PR 72 h |
| 注：CA：心脏骤停；PR：复苏后；NDS：神经功能缺损评分；NSE：神经元特异性烯醇化酶；S-100B：S-100B蛋白；与CA前相比，aP＜0.01 | ||||
| NDS | 0±0 | 172±42a | 113±48a | 75±42a |
| NSE (ng/mL) | 10.0±2.3 | 16.7±2.7a | 23.4±1.7a | 23.3±1.9a |
| S-100B (pg/mL) | 698±39 | 874±76a | 1160±51a | 1117±72a |
复苏后细胞因子TNF-α与IL-6的血清表达水平明显升高，复苏后2 h升高最快，随后呈缓慢升高趋势，与CA前相比差异均具有统计学意义(P＜0.01)，提示机体处于复苏后的炎症反应状态 (表 2)。复苏后的血乳酸水平明显升高，在复苏后2 h达高峰，随后出现下降，但仍然显著高于基础值(P＜0.01) (表 3)。
3 讨论本研究尝试建立长时程的猪室颤CA模型。首先选择猪作为实验动物，源于猪的代谢、心血管功能及心脏解剖等都与人很相似，已被认为人类CPR研究的最佳动物[10, 11]。其次，因为室颤是临床CA最常见的原因，本研究选择室颤法诱导CA。再者，考虑到院外患者多在经历8 min以上CA后才能得到救治，因而稳定可行的长时程CA模型将更利于临床CPR的前期基础研究。笔者参考文献[12]的猪模型方法，结合最新的2010年CPR指南要求[13]，制作了该动物模型。结果显示CA前所有动物的血流动力学、心功能参数及血乳酸水平等指标检测值与文献报道的基础值一致[12]。经诱颤电极放电后，动物的室颤发生率为100%；CPR期间，一次除颤成功率达50%，两次除颤成功率达28.6%，最终的复苏成功率为78.6%，且复苏成功的动物均存活72 h。早先，Wang等[14]建立长达15 min的猪室颤CA模型，结果复苏成功率仅为25%(2/8)。近来，Yannopoulos等[15]建立同样的动物模型，初始复苏成功率高达75%(9/12)，但是48 h存活率仅有8.3%(1/12)。因而，虽然15 min的CA模型可以造成更加严重的复苏后机体损伤，但动物短期病死率极高，并不适于心脏骤停后综合征的深入研究。此外，国内外学者多选择10 min以内作为CA时间。Tsai等[16]研究显示，动物经历10 min的 CA后，初始复苏成功率高达87.5%(7/8)，然而96 h存活率仅有25%。本研究制作的长时程猪室颤CA模型，模型稳定且复苏成功率高，动物存活时间长，为心脏骤停后综合征的基础研究提供较好的模型条件。
研究表明CA期间机体经历较长时间和完全的全身性缺血，紧接着自主循环恢复后的机体将处于一种异常的病理生理学状态，后者被称为心脏骤停后综合征。心脏骤停后综合征包括广泛的器官损伤，主要表现为CA后脑损伤、心功能障碍、全身性缺血-再灌注损伤以及持续存在的继发病变[17]。CA患者的预后主要与心脑器官的缺血-再灌注损伤程度有关，临床调查研究显示院外CA患者住院期间的死亡原因分析中，67.7%归因于复苏后脑损伤，23.1%与复苏后心功能不全有关[18]。即便存活的CA患者中，大多数长期存在不同程度的神经功能缺损与心功能障碍[19, 20]。组织病理研究显示，复苏后72 h时，电镜下仍可见神经细胞间隙增大，水肿明显，胞浆电子密度降低，线粒体肿胀、扩张、空泡变性；心肌细胞毛细血管微饮泡增多，间质水肿，心肌肌膜肿胀，出现退行性改变[21]。因此，本研究重点评价模型动物复苏后心脑器官的损伤情况。结果显示，机体经历10 min CA的打击后，所有动物的心功能参数如SV、GEF，下降至基础心功能的50%左右，同时血清cTNI与NT-proBNP水平大幅升高均提示CA后存在心肌细胞损伤与心力衰竭。通过脑功能评价发现CA后所有动物出现严重的神经功能缺损，同时血清NSE与S-100B水平升高提示CA后神经元明显受损。因此，本模型研究结果提示复苏后的心脑器官遭受缺血的严重损伤，在此基础上探讨心脏骤停后综合征的积极干预手段，将有助于改善CA患者复苏后心脑功能，进而改善预后。
目前认为，自主循环恢复后机体的反应是一个类似全身炎症反应的过程，这种炎症反应与最初的缺血-再灌注损伤程度有关[22]。模型中同时评价了复苏后机体的炎症反应状态，结果显示促炎细胞因子TNF-α和IL-6在复苏后24 h内持续增长，血清TNF-α升高4倍，血清IL-6升高3倍，结果提示自主循环恢复后机体处于全身炎症反应过程。当炎症反应过度，大量的炎症介质释放，导致机体反应过激、失控，将在此基础上发展为多脏器功能障碍，累及至肺时引起急性肺损伤[23]。笔者选择ELWI评价复苏后肺水肿程度，PVPI反应肺泡毛细血管通透性水平，结果显示复苏后的ELWI与PVPI值较CA前显著升高，结合PaO2/FiO2值＜300 mmHg，结果表明自主循环恢复后机体处于明显的全身炎症反应状态，并发生急性肺损伤。因而，该模型也可用于评价心脏骤停后综合征的机体炎症反应与急性肺损伤的干预效果。
本研究中存在一些不足。首先，模型能较好地观察心脏骤停后综合征的出现，如心肺脑器官功能不全、全身炎症反应及组织灌注不足，但笔者选择的观察周期较短，仅评估了复苏后72 h内的神经功能变化，24 h内的心功能与全身炎症反应，及4 h内的肺损伤与组织灌注情况，并不能全面动态了解长时程CA后动物多器官的损伤峰值及恢复情况。其次，我们仅选择观察动物重要器官的功能改变与血清标志物变化，尚缺乏从病理角度进一步评估各器官的组织损伤程度。
| [1] | 陈娣,杨光田. 心脏骤停复苏抢救的新进展[J]. 内科急危重症杂志,2009,15(3):156-158. |
| [2] | Zipes DP, Camm AJ, Borggrefe M, et al. ACC/AHA/ESC 2006 Guidelines for Management of Patients With Ventricular Arrhythmias and the Prevention of Sudden Cardiac Death:areport of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force and the European Society of Cardiology Committee for Practice Guidelines (writing committee to develop Guidelines for Management of Patients With Ventricular Arrhythmias and the Prevention of Sudden Cardiac Death): developed in collaboration with the European Heart Rhythm Association and the Heart Rhythm Society[J]. Circulation, 2006, 114(10): e385-484. |
| [3] | Weisfeldt ML, Becker LB. Resuscitation after cardiac arrest:a3-phase time-sensitive model[J]. JAMA, 2002, 288(23): 3035-3038. |
| [4] | van Alem AP, Vrenken RH, de Vos R, et al. Use of automated external defibrillator by first responders in out of hospital cardiac arrest: prospective controlled trial [J]. BMJ, 2003, 327(12):1312. |
| [5] | American Heart Association in collaboration with International Liaison Committee on Resuscitation. Guidelines 2000 for cardiopulmonary resuscitation and emergency cardiovascular care. Part 6: advanced cardiovascular life support[J]. Circulation, 2000, 102(8 Suppl): 1171-1186. |
| [6] | Nadkarni VM, Larkin GL, Peberdy MA, et al. First documented rhythm and clinical outcome from in-hospital cardiac arrest among children and adults[J]. JAMA, 2006, 295(1): 50-57. |
| [7] | Nolan JP, Neumar RW, Adrie C, et al. Post-cardiac arrest syndrome: epidemiology, pathophysiology, treatment, and prognostication.AScientific Statement from the International Liaison Committee on Resuscitation; the American Heart Association Emergency Cardiovascular Care Committee; the Council on Cardiovascular Surgery and Anesthesia; the Council on Cardiopulmonary, Perioperative, and Critical Care; the Council on Clinical Cardiology; the Council on Stroke[J]. Resuscitation, 2008, 79(3): 350-379. |
| [8] | Chen W, Weng Y, Wu X, et al. The effects ofanewly developed miniaturized mechanical chest compressor on outcomes of cardiopulmonary resuscitation inaporcine model[J]. Crit Care Med, 2012, 40(11): 3007-3012. |
| [9] | Berg RA, Otto CW, Kern KB, et al. High-dose epinephrine results in greater early mortality after resuscitation from prolonged cardiac arrest in pigs:aprospective, randomized study[J]. Crit Care Med, 1994, 22(2): 282-290. |
| [10] | 涂建锋, 蒋国平, 江观玉. 心脏骤停动物模型的动物和实验方法选择[J]. 中国病理生理杂志, 2006, 22(4): 830-832. |
| [11] | Idris AH, Becker LB, Ornato JP, et al. Utstein-style guidelines for uniform reporting of laboratory CPR research.Astatement for healthcare professionals fromatask force of the American Heart Association, the American College of Emergency Physicians, the American College of Cardiology, the European Resuscitation Council, the Heart and Stroke Foundation of Canada, the Institute of Critical Care Medicine, the Safar Center for Resuscitation Research, and the Society for Academic Emergency Medicine[J]. Circulation, 1996, 94(9): 2324-2336. |
| [12] | Xu J, Hu X, Yang Z, et al. Miniaturized mechanical chest compressor improves calculated cerebral perfusion pressure without compromising intracranial pressure during cardiopulmonary resuscitation inaporcine model of cardiac arrest[J]. Resuscitation, 2014, 85(5): 683-688. |
| [13] | Hazinski MF, Nolan JP, Billi JE, et al. Part 1: Executive summary: 2010 International Consensus on Cardiopulmonary Resuscitation and Emergency Cardiovascular Care Science With Treatment Recommendations[J]. Circulation, 2010, 122(16 Suppl 2): S250-275. |
| [14] | Wang H, Barbut D, Tsai MS, et al. Intra-arrest selective brain cooling improves success of resuscitation inaporcine model of prolonged cardiac arrest[J]. Resuscitation, 2010, 81(5): 617-621. |
| [15] | Yannopoulos D, Segal N, Matsuura T, et al. Ischemic post-conditioning and vasodilator therapy during standard cardiopulmonary resuscitation to reduce cardiac and brain injury after prolonged untreated ventricular fibrillation[J]. Resuscitation, 2013, 84(8): 1143-1149. |
| [16] | Tsai MS, Barbut D, Wang H, et al. Intra-arrest rapid head cooling improves postresuscitation myocardial function in comparison with delayed postresuscitation surface cooling[J]. Crit Care Med, 2008, 36(11 Suppl): S434-439. |
| [17] | Neumar RW, Nolan JP, Adrie C, et al. Post-cardiac arrest syndrome: epidemiology, pathophysiology, treatment, and prognostication[J]. Circulation, 2008, 118(23): 2452-2483. |
| [18] | Laver S, Farrow C, Turner D, et al. Mode of death after admission to an intensive care unit following cardiac arrest[J]. Intensive Care Med, 2004, 30(11): 2126-2128. |
| [19] | Wachelder EM, Moulaert VR, van Heugten C, et al. Life after survival: long-term daily functioning and quality of life after an out-of-hospital cardiac arrest[J]. Resuscitation, 2009, 80(5): 517-522. |
| [20] | Gazmuri RJ, Weil MH, Bisera J, et al. Myocardial dysfunction after successful resuscitation from cardiac arrest[J]. Crit Care Med, 1996, 24(6): 992-1000. |
| [21] | 王金高, 蔺际, 张民伟, 等. 经皮电刺激心肌建立兔心脏骤停后综合征模型[J]. 中华急诊医学杂志, 2014, 23(4): 393-398. |
| [22] | Adrie C, Adib-Conquy M, Laurent I, et al. Successful cardiopulmonary resuscitation after cardiac arrest asa"sepsis-like" syndrome[J]. Circulation, 2002, 106(5): 562-568. |
| [23] | Welty-Wolf KE, Carraway MS, Ortel TL, et al. Coagulation and inflammation in acute lung injury[J]. Thromb Haemost, 2002, 88(1): 17-25. |